ИСТИНА

В основе жизни всех организмов на земле лежит процесс биосинтеза белка, осуществля- емый рибосомой, которая декодирует информацию, записанную в матричной РНК (мРНК), и переводит ее последовательность аминокислот. мРНК участвует в этом процесса в каче- стве посредника при передаче наследственной информации с ДНК на рибосому, но в то же время сама последовательность и структура мРНК может влиять на уровень трансляции, а, следовательно, и на экспрессию гена. Эффективность бактериальной трансляции в первую очередь зависит от хорошо из- вестного элемента 5’-нетранслируемой области (5’-НТО) - последовательности Шайна- Дальгарно, комплементарной 3’-концу 16S рибосомной РНК (рРНК) [1]. Во многих ра- ботах была показана зависимость эффективности трансляции от длины и расположения данного сайта, однако, в ходе наших исследований было обнаружено, что далеко не все наблюдаемые для природных мРНК особенности эффективности трансляции могут быть объяснены только исходя из структуры последовательности Шайна-Дальгарно. Довольно хорошо изучено влияние вторичной структуры мРНК на эффективность трансляции - в большинстве случаев у генов с высоким уровнем экспрессии стабильность вторичной структуры значительно снижена в участке инициации трансляции. Существует RBS Calculator, в основе которого лежит термодинамическая модель, оценивающая силу молекулярных взаимодействий 30S комплекса с мРНК транскриптом, и с помощью него можно предсказать относительную скорость инициации трансляции [2]. В ходе нашей ра- боты была проведена оценка такой скорости для конструкций с различными природными 5’-НТО и сравнивалась с результатами, полученными in vivo с использованием конструк- ции, основанной на двух флуоресцентных белков RFP и CER, первый из которых (RFP) является внутренним контролем, а экспрессия второго (CER) отражает эффективность той или иной 5’-НТО мРНК [3]. В результате было показано, что опять же не все получа- емые эффекты можно объяснить стабильностью вторичной структуры мРНК. Мы разработали новый подход для изучения влияния структуры 5’-НТО на эффек- тивность трансляции, для этого были созданы библиотеки плазмид с рандомизирован- ным участком перед геном CER. Использование клеточного сортера позволило в зави- симости от отношения эффективностей трансляции двух флуоресцентных белков RFP и CER с высокой точностью разделять клетки с различными плазмидами. После прове- дения крупномасштабного секвенирования и применения статистических методов были определены последовательности, отличные от уже известных из литературы, с определен- ным уровнем экспрессии белков. Для выбранного набора 5’-НТО была сделана оценка с помощью RBS Calculator и оценка транскрибируемости с использованием RT-PCR, чтобы исключить доказательство полученных результатов за счет вклада стабильности вторич- ной структуры либо транскрипции. Полученные результаты интересны, с одной стороны, с фундаментальной точки зрения, поскольку позволяют лучше понять, как последователь- ность 5’-нетранслируемой области бактериальных мРНК влияет на эффективность такого сложного процесса, как трансляция. С другой стороны, они могут быть использованы на практике для создания систем регулируемой экспрессии белков в клетках E. coli.