ИСТИНА

Проблема Классические представления о роли мезенхимальных стромальных клеток (МСК) в регенерации тканей ограничивают их участие фазами репарации и ремоделирования. Принято считать, что МСК участвуют в восстановлении трехмерной структуры ткани за счет синтеза внеклеточного матрикса, а также способствуют ангиогенезу за счет выделения паракринных факторов. Однако результаты многочисленных исследований in vivo и in vitro указывают на то, что во время фазы острого воспаления в очаге поражения МСК оказывают иммуносупрессивное действие, которое проявляется в подавлении активации иммунокомпетентных клеток. Известно, что МСК выделяют иммуносупрессивные факторы только в ответ на воздействие провоспалительного микроокружения и в частности комплекса провоспалительных цитокинов, секретируемого иммунными клетками. В отсутствие воспаления МСК наоборот поддерживают пролиферацию лимфоцитов. Несмотря на то, что иммуносупрессивные свойства МСК активно изучаются, механизмы, посредством которых осуществляется подавление воспалительной реакции, до сих пор не изучены. Известно, что МСК активируются под действием таких растворимых факторов, как: провоспалительные цитокины IFN-gamma (интерферон гамма), TNF-alpha (фактор некроза опухоли альфа), IL-1 (интерлейкин-1). Однако межклеточные контакты, осуществляемые в основном за счет молекул адгезии, также играют определенную роль в этих процессах. Провоспалительные цитокины активируют в МСК гены, кодирующие белки, участвующие в регуляции активации лимфоцитов, такие как iNOS (индуцибельная NO-синтаза), COX2 (циклооксигеназа 2/простагландин-эндопероксид синтаза 2), IDO (индоламин-2,3-дезоксигеназа), TGF-betta (трансформирующий фактор роста бета) и других, ответственных за иммуносупрессивный ответ. Продукты реакций, катализируемые этими ферментами, секретируются во внеклеточную среду, где непосредственно взаимодействуют с лимфоцитами. Методы и подходы Для изучения предполагаемых механизмов супрессии активации лимфоцитов под действием МСК мы разработали систему сокультивирования МСК жировой ткани человека с лимфоцитами периферической крови (ЛПК), активированными фитогемагглютинином, которая предполагала контактное взаимодействие между МСК и лимфоцитами и культивирование в отсутствие контактов с использованием системы полупроницаемых мембран (трансвелл) в различных соотношениях. Для исследования способности МСК угнетать пролиферацию активированных лимфоцитов мы использовали метод CyQUANT®NF. Этот метод основан на связывании флуоресцирующего красителя с молекулой ДНК. Так как количество ДНК в клетке жёстко регулируется, можно сопоставить/скоррелировать количество ДНК, связавшееся с красителем, с количеством клеток, получая, таким образом, простой инструмент для оценки разницы в пролиферации между клетками контроля и клетками, обработанными определёнными реагентами. Для анализа цитокинового профиля в сокультуре МСК жировой ткани человека и активированных ЛПК использовали технологию Bioplex, основанную на интеграции иммуноферментного метода и метода проточной цитофлюориметрии, которая позволяет производить количественный анализ значительного числа цитокинов, хемокинов, факторов роста в одном образце одновременно. Для измерения уровня экспрессии белков - маркеров активации на поверхности активированных ЛПК и МСК жировой ткани человека был использован метод проточной цитофлюориметрии. Для анализа уровня экспрессии мРНК белков iNOS, COX2, IDO использовали ПЦР в реальном времени. Результаты и выводы Согласно полученным данным измерения пролиферации клеток методом CyQuant, нами установлено, что эффект подавления пролиферации активированных ЛПК в присутствии МСК жировой ткани человека зависит от соотношения этих клеток в сокультуре. Наибольший эффект подавления пролиферации активированных лимфоцитов наблюдали при соотношении клеток 1:25 (МСК:ЛПК), при этом соотношении уровень пролиферации ЛПК составил 40 % по отношению к уровню пролиферации лимфоцитов, культивировавшихся без МСК в стандартных условиях. При соотношении клеток 1:10 (МСК:ЛПК) наблюдали обратный эффект - стимуляцию пролиферации активированных лимфоцитов. Кондиционированая среда, в которой росли МСК жировой ткани человека, не оказывала детектируемого эффекта на пролиферацию активированных ЛПК. Степень подавления и стимуляции пролиферации активированных лимфоцитов в присутствии МСК жировой ткани не зависела от наличия межклеточных контактов. Анализ экспрессии цитокинов с помощью технологии Bioplex в супернатантах кокультур показал, что культивирование активированных ЛПК в присутствии МСК жировой ткани человека в соотношении 50:1 приводило к значительному повышению в IL-1b и TNF-alpha в среде кокультивирования, при чем повышенный уровень этих цитокинов обнаруживался только в условиях бесконтактного сокультивирования. Концентрация IL-1b и TNF-alpha возрастала в 3-5 раз по сравнению с суммой концентраций этих цитокинов в супернатантах от МСК жировой ткани и активированных ЛПК, культивируемых отдельно. Уменьшение соотношения в бесконтактной кокультуре активированных ЛПК и МСК жировой ткани приводило к относительному снижению уровню IL-1b и TNF-alpha в супернатантах. В этих же условиях концентрации IFN-gamma, IL-2, IL-5, IL-6 существенно не изменялись. Культивирование активированных ЛПК в присутствии МСК жировой ткани человека в соотношении 25:1 приводило к значительному повышению в среде сокультивирования IL-10 независимо от наличия межклеточных контактов. Концентрация IL-10 возрастала больше чем в 2,5-6 раз по сравнению с суммой концентраций этих цитокинов в супернатантах отдельных кокультур МСК жировой ткани и активированных ЛПК. При других соотношениях клеток относительная концентрация IL-10 существенно не менялась. Эффект повышения концентрации IL-10 при кокультивировании клеток в соотношении 1:25 соотносится с эффектом подавления пролиферации активированных лимфоцитов в этих же условиях. Секреция IL-10 может являться одним из механизмов подавления активации лимфоцитов в присутствии МСК жировой ткани. Анализ уровня экспрессии мРНК белков показал, под действием провоспалительных цитокинов в МСК жировой ткани происходит индукция синтеза таких ферментов как IDO и iNOS предположительно участвующих в механизмах иммуносупрессии. В МСК жировой ткани, культивируемых в стандартных условиях, мРНК этих ферментов не обнаруживалась. Уровень экспрессии IDO в МСК жировой ткани был существенно повышен в контактных кокультурах МСК и активированных лимфоцитов. Максимальный уровень экспрессии IDO отмечался при культивировании МСК жировой ткани и активированных лимфоцитов в соотношении 1:25. Известно, что IDO катализирует превращение незаменимой аминокислоты триптофана в кинуренин. Истощение среды культивирования по триптофану препятствует синтезу белков в клетках, нарушает метаболизм клеток, и, следовательно, отрицательно влияет на активацию и пролиферацию лимфоцитов. В противоположность IDO уровень экспрессии iNOS в МСК жировой ткани существенно повышался при кокультивировании МСК жировой ткани и активированных лимфоцитов бесконтактным способом. При уменьшении соотношения клеток в кокультуре снижался и уровень экспрессии мРНК iNOS в МСК жировой ткани. Образование значительного количества NO, катализируемого iNOS, может являться причиной гибели клеток в результате повреждения ДНК или клеточных структур, и одним из механизмов иммуносупрессивного действия МСК на лимфоциты. Анализ индукции апоптоза среди лимфоцитов показал, что в присутствии МСК количество апоптотических клеток не меняется или незначительно снижается по сравнению со стандартными условиями культивирования. Относительное снижение количества апоптотических лимфоцитов особенно ярко проявлялось в условиях бесконтактного кокультивирования лимфоцитов и МСК жировой ткани и прямопропорционально зависело от соотношения клеток в кокультуре. Этот эффект также корреллировал с уровнем секреции TNF-alpha в этих же условиях. Характер зависимостей количества апоптотических лимфоцитов от соотношения клеток в кокультуре с МСК жировой ткани был сходным для CD4+Ann+7AAD- и CD4-Ann+7AAD- субпопуляций лимфоцитов. Однако, в присутствии МСК жировой ткани возрастало количество апоптотических клеток в субпопуляции активированных СD4+CD25+ Т-клеток по сравнению со значениями, полученными в стандартных условиях культивирования, и при культивировании с супернатантом МСК. Возможно, снижение пролиферации активированных лимфоцитов в присутствии МСКс жировой ткани можно объяснить апоптозом активированных Т-лимфоцитов. Активация лимфоцитов приводила к возрастанию их способности образовывать плотные межклеточные контакты с МСК жировой ткани. Прикреплённые клетки анализировали с помощью метода проточной цитометрии, предварительно инкубируя их с флуоресцентными антителами на маркёры Т-клеток CD4 (кластер дифференцировки 4), CD25 (кластер дифференцировки 25) и CD8 (кластер дифференцировки 8), а также на маркёры натуральных киллеров (НК-клетки) и B-клеток. Было обнаружено, что процент активированных CD4+ T-клеток, прикрепившихся к МСК жировой ткани человека, существенно возрастал по сравнению с не активированными лимфоцитами. В то время относительное содержание клеток других типов (НК, В-клетки, CD8+Т-клетки) при активации снижался в условиях контактных взаимодействий МСК жировой ткани. Таким образом, мы предполагаем, что контактные взаимодействия между активированными CD4 T-клетками и МСК жировой ткани возможно могут являться одним из важных факторов активации МСК. Полученные результаты показали, что культивирование активированных лимфоцитов периферической крови в присутствии МСК жировой ткани контактным и бесконтактным способом приводит к подавлению их пролиферации. Возможными механизмами подавления активации лимфоцитов могут являться повышение секреции IL-10 и индукция апоптоза активированных лимфоцитов под действием МСК жировой ткани. Однако, механизмы посредством которых МСК жировой ткани осуществляют этот эффект, по-видимому, различаются и зависят от окружающих условий. Ранее было показано, что для индукции экспрессии IDO необходим IFN-gamma. Экспрессию iNOS в МСК вызывают IL-1b и TNF-alpha. Нами было показано, что при кокультивировании МСК жировой ткани с активированными лимфоцитами именно в условиях контактного взаимодействия возрастает уровень экспрессии IDO в МСК. Возможно, межклеточные контакты между СD4+ Т-лимфоцитами и МСК жировой ткани задействованы в индукции экспрессии IDO. При кокультивировании МСК жировой ткани с активированными лимфоцитами с использованием полупроницаемых мембран возрастает уровень экспрессии iNOS в МСК. Одновременно в этих условиях происходит увеличение секреции IL-1b и TNF-alpha. Анализ полученных результатов позволяет предположить, что IFN-gamma и TNF-alpha играют крайне важную роль в иммуносупрессивной активности МСК жировой ткани человека, при этом каждый из них вовлечён в независимый механизм действия активированных МСК жировой ткани.