ИСТИНА

Для химико-энзиматического синтеза пептидных субстратов протеаз в органических растворителях предложены биокатализаторы на основе трипсина (Тр), химотрипсина (ХТР), субтилизина (СЛ) и термолизина (ТЛ), иммобилизованных на криогеле поливинилового спирта (криоПВСГ) и хитозане. Получение иммобилизованных биокатализаторов проводили путем присоединения ферментов к криоПВСГ или хитозану после модификации носителя с помощью глутарового альдегида. Содержание белка на криоПВСГ в зависимости от условий проведения иммобилизации варьировало в пределах 1.6 -15 мг/г носителя. На хитозане содержание ферментов было значительно выше - до 120 мг/г носителя. Наибольшей стабильностью обладали Тл и Тр, иммобилизованные на криоПВСГ - не менее 80% первоначальной активности даже через 8-10 месяцев хранения. Иммобилизованный Сл через 5 месяцев хранения сохранял более 50% активности, в то время как активность нативного Сл в этих условиях снижалась до 40% уже через 3 суток. Активность иммобилизованных ферментов по сравнению с нативными была выше при кислых и щелочных значениях рН, а также при 60-800С. Полученные биокатализаторы характеризуются высокой стабильностью в средах полярных органических растворителей. Все препараты иммобилизованных катализаторов проявляли высокую синтазную активность в органической среде. Для выяснения факторов, влияющих на эффективность синтеза субстратов, проведены эксперименты по ферментативному синтезу флурогенного и хромогенного субстратов цистеиновых протеаз - Abz-Phe-Ala-pNA и Glp-Phe-Ala-pNA. Синтез Abz-Phe-Ala-pNA был проведен в смесях DMF-MeCN и DMF-EtOH с использованием иммобилизованных на криоПВСГ препаратов ХТР и Сл. Показано, что для получения Abz-Phe-Ala-pNA наилучшие результаты получены в смеси DMF-MeCN (20/80 об. %). При соотношении фермент-субстрат 1:2500 в синтезе с иммобилизованным ХТР выход продукта через 2 ч достигал 32 %, а через 24 ч – 70%. В случае использования иммобилизованного Сл при соотношении фермент - субстрат 1:5400 наблюдалось более медленное накопление продукта – выход пептида через 24 ч составил лишь 21 %. При увеличении содержания фермента в 2 раза эффективность синтеза возросла незначительно (выход продукта за 24 ч составил 35 %). Аналогичные эксперименты были проведены в случае синтеза Glp-Phe-Ala-pNA. При проведении синтеза в безводной среде в смеси DMF-MeCN (40/60 об. %) под действием биокомпозита ХТР-хитозан при соотношении фермент-субстрат 1:1500 выход целевого пептида через 24 ч составил 70 %. Синтез пептида в этих же условиях, катализируемый ХТР, иммобилизованным на криогеле ПВС, при соотношении фермент-субстрат - 1:3900 моль/моль протекал более эффективно. Уже через 2 ч выход продукта составил 84%, а через сутки - 88%. Использование для катализа образования пептидной связи СЛ, иммобилизованного на криогеле ПВС, приводило к еще большему возрастанию эффективности синтеза. Выход продукта уже через 2 ч достигал 52 %, а через 24 ч – 95 %. Исследованные закономерности позволили разработать эффективную схему химико-энзиматического синтеза серии высокоспецифичных субстратов цистеиновых пептидаз.