ИСТИНА |
Войти в систему Регистрация |
|
ИСТИНА ИНХС РАН |
||
В РНК имеются более полутора сотен видов разных модифицированных нуклеотидов. Интерес к этой теме возрос в последние годы, потому что зарубежными коллегами было показано, что модификация матричных РНК в эукариотических организмах может иметь регуляторное значение, и есть целая система, которая метилирует матричную РНК. Существует система узнавания модифицированных нуклеотидов, которая выполняет различные функции. Самая изученная из них это система деградации мРНК. Также есть система удаления подобных модификаций. Напомню, что в эукариотических клетках фактически 2 независимые системы биосинтеза белка. Одна работает в цитоплазме, другая в митохондриях. И те и другие рибосомы характеризуются перекрывающимся, но все же, различным спектром модифицированных нуклеотидов (Рис. 1). В отличие от бактерий, ферментативный аппарат модификации РНК в эукариотах изучен не столь хорошо и оставались еще несколько белых пятен, в частности, мы обратили внимание на довольно интересный феномен эволюционной взаимосвязи модификаций между бактериальными и эукариотическими рибосомами. Рисунок 1. Набор модифицированных нуклеотидов цитоплазматических (вверху) и митохондриальных (внизу) рибосом отличается. У бактерий нуклеотид С1402 16S рРНК модифицирован двумя метильными группами, которые вносятся двумя независимыми ферментами. У эукариот эти 2 типа модификации разнесены по компартментам клетки. В цитоплазматической рибосоме остается метилирование рибозы, проходящее по мяоРНК зависимому механизму. В митохондриальной рибосомной РНК сохраняется модификация гетероциклического основания. И до последнего времени не было известно, кто же осуществляет эту модификацию. Чтобы это понять, мы поискали гены млекопитающих, похожие на ген, который делает ту же самую модификацию в бактериях. Нашли гомолог и воспользовались системой CRISPR/Cas9 чтобы инактивировать этот ген. Чтобы проверить, исчезла ли модификация, нам пришлось разработать многоступенчатую схему (Рис. 2). Рисунок 2. Схема выделения участка рРНК и анализа его модификаций. Мы брали биотинилированный олигонуклеотид, комплементарный участку предполагаемой модификации. Разрезали РНКазами все, что не комплементарно этому олигонуклеотиду и пользовались биотином, который присоединен к дуплексу, для аффинной очистки целевого фрагмента РНК. Разрезали выделенный фрагмент РНК на более короткие олигонуклеотиды, которые анализировали масс-спектрометрически. Фрагмент РНК, выделенный из нокаутных линий клеток действительно оказался легче на массу метильной группы. Следующий фермент, которым мы занялись, задал нам больше задачек. Дело в том, что мы решили определить фермент, который занимается модификацией, которая характерна только для митохондрий позвоночных. Такой модификации нет в бактериях и такой модификации нет в митохондриях дрожжей, т.е. это исключительно приобретение довольно позднее в эволюции. Поэтому у нас не было гомолога, чтобы осуществить биоинформатический поиск. Тогда мы воспользовались следующим соображением. Химически такой тип модифицирующих ферментов присутствует в дрожжах, и есть фермент, который модифицирует транспортное РНК. Фактически он создает риботимидин в T-петле транспортной РНК. У млекопитающих этот ген дуплицирован, и первый из паралогов более похож на дрожжевой ген, и мы думаем, что он модифицирует транспортную РНК. А второй ген менее похож на исходный, поэтому мы предположили, что он мог приобрести дополнительную мишень, т.е. произошла дивергентная эволюция. Мы воспользовались системой CRISPR/Cas9, чтобы сделать нокаут на клеточных линиях и воспользовались примерно той же схемой выделения фрагмента митохондриальной РНК, для того чтобы проверить, модифицирован ли он. Наша гипотеза оказалась верной. Самое интересное, на наш взгляд, это изучать те гены, которые имеют выраженную тканеспецифичную экспрессию и работают только в контексте всего организма. Чтобы изучать их функцию, недостаточно использовать клеточные линии, нужно проводить манипуляции с геномом мышей. Мы организовали группу в Московском университете для получения мышей с измененным геномом. Для создания нокаутных и трансгенных мышей необходимо поддерживать несколько популяций мышей: это мышки-доноры яйцеклеток, мышки-реципиенты, которые покрываются вазэктомированными самцами, которые получаются оперативным путем в нашем центре. Соответственно, инъецированные яйцеклетки подсаживаются мышам-реципиентам, которые рождают мышат, которых мы генотипируем. Как выглядит наш небольшой трансгенный блок показано на рисунке 3. Это комната для содержания мышек с индивидуальными вентилируемыми клетками и операционная комната, где мы извлекаем яйцеклетки, здесь проводим микроинъекции и здесь же подсаживаем клетки мышке-реципиенту. Рисунок 3. Вид комнаты с оборудованием для получения мышей с измененным геномом. Чтобы проиллюстрировать работу этой системы, я поделюсь с вами неопубликованными и даже пока незавершенными данными по еще одной РНК метилтрансферазе, которую как раз можно изучать исключительно на модели мышей и нельзя изучать на модели клеток. Это РНК метилтрансферза, которая обладает исключительно тканеспецифичной экспрессией. Она появляется только в семенниках самцов млекопитающих, и в частности мышей. Чтобы изучать функции этого гена, мы внедрили аффинный довесок прямо в ген его природном окружении, и это позволяет нам выделять белок прямо из экстракта семенников мышей. С помощью этого метода мы надеемся определить белковых партнеров. Эта работа сейчас ведется. Антитела на этот довесок позволили нам увидеть, что этот ген экспрессируется на самом позднем этапе сперматогенеза. Мы также сделали нокаут этого гена с помощью системы CRISPR/Cas9 в мышах, и видим очень значительное снижение фертильности у самцов, не имеющих ни одной копии активного гена исследуемой метилтрансферазы. Работа ведется при поддержке Российского научного фонда (грант 17-75-30027).