ИСТИНА

Многие ферменты, применяемые в биотехнологии, используют дорогой и нестабильный NADH/NADPH в качестве кофермента. Поэтому для снижения стоимости процесса применяются схемы с регенерацией кофактора. Регенерация может быть осуществлена за счет использования дополнительного фермента, ко-экспрессии основного и дополнительного ферментов одновременно (whole cell biocatalyst), а также за счет получения гибридного белка. В гибридном ферменте два фермента объединены в одну полипептидную цепь за счет специального линкера. Такая конструкция позволяет активным центрам ферментов сближаться друг с другом и молекула кофактора, восстановленного в активном центре одного фермента, может быстрее достигнуть активного центра другого фермента. NAD(P)+-зависимая формиатдегидрогеназа (ФДГ, КФ 1.2.1.2.) – это фермент, широко использующийся в системах с регенерацией кофактора. Основными преимуществами этого фермента являются широкий pH-оптимум активности (6-9,5), высокая температурная стабильность, простота удаления из реакционной смеси продукта реакции – CO2, а также относительно невысокая стоимость основного субстрата – формиат иона. Большинство ФДГ являются NAD+-зависимыми ферментами. В нашей лаборатории методом направленного мутагенеза некоторое время назад были получены мутантные формы ФДГ из бактерий Pseudomonas sp 101, обладающие специфичностью к NADP+, поскольку многие ферменты используют NADPH в качестве кофактора. Одной из наиболее интересных групп ферментов, широко используемых в биотехнологии, являются монооксигеназы. Большинство из них используют в качестве кофактора именно NADPH. В рамках данной работы было получено несколько генетических конструкций, содержащих гены, кодирующие монооксигеназу и ФДГ. Была проведена экспрессия и очистка гибридных ферментов и разные варианты гибридных ферментов были получены в активной и растворимой форме. Все ферменты проявляли активность как по части ФДГ так и по части монооксигеназы. Было проведено сравнение свойств гибридных ферментов и смеси ферментов и показано, что в некоторых случаях фьюжн системы работают более эффективно, чем смесь отдельных белков. Исследование выполнено при финансовой поддержке РФФИ и Правительства Москвы в рамках научного проекта № 19-34-70036.