ИСТИНА |
Войти в систему Регистрация |
|
ИСТИНА ИНХС РАН |
||
α-синуклеин (α-syn) в норме экспрессируется во многих тканях человеческого организма, при этом максимальные уровни экспрессии наблюдаются в клетках коры головного мозга. При болезни Паркинсона и других синуклеинопатиях показано накопление этого белка в тельцах Леви. Механизмы образования таких белковых агрегатов, а также механизмы их нейротоксичности не до конца ясны. Для изучения влияния скорости накопления α-syn на его агрегацию в данной работе был проведен сравнительный анализ модельных систем на основе перевиваемой клеточной линии нейробластомы человека SH-SY5Y. Для этого были использованы три экспериментальных системы: химическая трансфекция, лентивирусная трансдукция клеток и получение стабильно трансформированных клеточных линий. Указанными методами были получены клетки с повышенной экспрессией гена α-Syn дикого типа, а также мутантного α-syn А53Т, для которого в литературе показана ассоциация с аутосомно-доминантным наследуемым типом болезни Паркинсона. Во всех случаях экспрессия осуществлялась под контролем конститутивного промотора цитомегаловируса CMV. Наличие трансгена в моноклональных стабильно трансформированных клеточных линиях проверяли методом ПЦР. Для всех типов клеток показано избыточное накопление целевого белка методом иммуноцитохимии с антителами, специфичными к α-syn. Из указанных модифицированных клеток, а также контрольных интактных клеток, были получены фракции растворимых и нерастворимых в 1% Triton X-100 белков. Параллельно с этим, методами кислотного осаждения примесных белков, а также кристаллизацией с сульфатом аммония, была получена фракция белков, обогащенная α-syn. Указанные фракции были проанализированы с помощью вестерн блот анализа, для обогащенных фракций анализ проводился после ПААГ-электрофореза в восстанавливающих и невосстанавливающих условиях. Полученные данные позволяют сравнивать степень олигомеризации α-syn мутантного и дикого типа в экспериментальных клеточных системах с разной скоростью накопления этого белка. Работа выполнена в рамках проекта Российского научного фонда 1614-10027.