ИСТИНА

Система репарации неканонических пар или «мисматчей», получившая название MMR (от анг. Mismatch repair system), исправляет ошибки, допущенные полимеразой при репликации ДНК. Одним из основных белков системы репарации является MutS, который узнает и связывает ДНК в месте нахождения «мисматча». После связывания АТФ MutS изменяет конформацию и взаимодействует со следующим участником системы репарации – белком MutL. Комплексы белков репарации с ДНК являются конформационно подвижными, что затрудняет их изучение. Для решения этой проблемы нами был предложен метод получения конъюгата моноцистеиновой формы белка MutS с модифицированной ДНK, содержащей в 5-ом положении остатка тимидина пиридилдитиогруппу на линкерах различной длины. Также был разработан способ очистки конъюгата, позволяющий сохранять способность MutS в его составе сгибать и разгибать ДНК. В данной работе в гомогенном состоянии получены конъюгаты мутантных форм MutS(N497C) и MutS(A336C) с ДНК. В первом случае ДНК зафиксирована в области MutS, сближенной с ДНК, но не участвующей в распознавании «мисматча», во втором – в полости, формирующейся при изменении конформации белка на «скользящий зажим». Методом FRET показана способность выделенных комплексов MutS-ДНК взаимодействовать с MutL. Однако MutL с большей скоростью и более эффективно связывается с MutS(N497C) в составе конъюгата по сравнению с MutS(A336C)-ДНК. Таким образом показано, что комплекс MutS(N497C)-ДНК является предпочтительным для привлечения MutL и дальнейшей активации всей системы MMR. Изучена кинетика образования комплекса MutL с MutS в составе конъюгата для разных конформационных состояний белка MutL («открытая» и «закрытая» формы). Продемонстрировано, что скорость образования тройного комплекса MutL-MutS-ДНК и его количество зависят не только от места «сшивки» MutS с ДНК, но и от длины линкера между белком и ДНК. Предложенный подход позволяет выяснить положение ДНК относительно MutS и MutL в тройном комплексе на определенной стадии функционирования системы репарации.