ИСТИНА

В процессе репликации из-за неточности работы полимераз в ДНК возникают некомплементарные пары нуклеотидов, являющиеся источником последующих мутаций в генах. В живых организмах от бактерий до человека существует система репарации таких неканонических пар, получившая название MMR (от анг. Mismatch repair system). Система MMR восстанавливает «мисматчи» в ДНК, понижая вероятность возникновения мутаций в 50-1000 раз. На первом этапе функционирования системы репарации белок MutS узнает и связывает ДНК в месте нахождения «мисматча». На следующем этапе происходит связывание молекулы АТФ белком, приводящее к значительным конформационным изменениям в MutS. В данной работе использован метод ковалентного присоединения (кросслинкинга) белка MutS к ДНК, с целью фиксации короткоживущих и конформационно подвижных комплексов, образующихся в процессе функционирования MMR. Для кросслинкинга использован модифицированный ДНК-фрагмент, содержащий пиридилдитиогруппу. Разработан метод получения конъюгата MutS-ДНК c высоким выходом и способ его очистки. Активность белка в полученном комплексе, тестируемая по его способности изменять конформацию и сгибать/разгибать ДНК, продемонстрирована методом флуоресцентного резонансного переноса энергии. Измерена кинетика процесса перехода белка в конформационно активное состояние (так называемый «скользящий зажим») с помощью метода «остановленной струи». Показано, что скорость конформационного перехода в белке зависит от концентрации АТФ. Продемонстрировано, что ковалентно связанный комплекс MutS-ДНК способен привлекать следующего участника системы MMR– белок MutL.