ИСТИНА

NAD+-Зависимая формиатдегидрогеназа (ФДГ, КФ 1.2.1.2.) является белком стресса для растений, патогенных бактерий и дрожжей. Также этот фермент широко используется в биотехнологических процессах для регенерации кофактора. Все вышесказанное обуславливает интерес к этому ферменту как с фундаментальной так и с прикладной точек зрения. В нашей лаборатории проводятся систематический исследования по клонированию и экспрессии в E.coli генов ФДГ из разных источников. Все формиатдегидрогеназы, для которых было проведено клонирование и экспрессия гена, получены в активной форме и охарактеризованы. Также нами проводятся систематические исследования взаимосвязи структура-функция этого фермента – поиск в банках данных и анализ аминокислотных последовательностей ФДГ из различных источников, изучение свойств клонированных ФДГ дикого типа, кристаллизация, решение и анализ трехмерных структур, эксперименты по рациональному дизайну для получения мутантных ФДГ с новыми или улучшенными свойствами. В настоящем докладе представлены последние данные по сравнению свойств и структурных особенностей новых ФДГ из различных источников. Недавно нами были клонированы гены трех новых ФДГ – из патогенных бактерий Staphylococcus aureus (SauFDH), термотолерантных дрожжей Ogataea parapolymorpha (OpaFDH) и мха Physcomitrella patens (PpaFDH). Было показано, что по аминокислотной последовательности SauFDH является наиболее эволюционно удаленным белком от ФДГ из других источников, а также значительно отличается по свои кинетическим свойствам – у SauFDH Км по обоим субстратам были в несколько раз хуже, а по удельной активности минимум в 2,5 раза выше, чем соответствующие значения у других описанных в литературе ФДГ. Кроме того SauFDH демонстрирует одну из самых высоких среди ФДГ термостабильностей. Новые и важные результаты также были получены и для ФДГ из эукариот. Сравнение свойств рекомбинантной OpaFDH с другими ФДГ показало, что OpaFDH имеет одни из самых лучших показателей каталитической эффективности, сравнимые с данными для ФДГ из растений и при этом является гораздо более термостабильным белком, уступающим только ФДГ из бактерий Pseudomonas sp. 101 (PseFDH) и SauFDH. Нами было впервые в мире проведено клонирование полноразмерного гена ФДГ из мха. После клонирования полноразмерная PpaFDH, включающая и сигнальный пептид размером более 60 аминокислот, также впервые в мире для ФДГ растений была экспрессирована в клетках E.coli в растворимой и активной форме. Ранее для других ФДГ растений такие эксперименты заканчивались получением телец включения. Был проведен анализ структуры и размера сигнального пептида (один из самых длинных среди генов ALU растений) и предложено несколько точек отщепления сигнального пептида. Ферменты с укороченным N-концом были получены и охарактеризованы. Показано, что для одной из форм PpaFDH уровень экспрессии в клетках E.coli почти в 10 раз выше по сравнению с другими вариантами и полноразмерным ферментом, что может косвенно свидетельствовать о том, что именно такая форма PpaFDH преимущественно синтезируется в клетке. Работа выполнена при финансовой поддержки Российского научного фонда (грант 16-14-00043) и Российского фонда фундаментальных исследований (гранты 14-04-01625-a, 14-04-01665-a). Acta Naturae, 2016, т. 2, с. 33-34