ИСТИНА

Одной из основных задач системы репарации неканонических пар нуклеотидов или «мисматчей» (MMR) является поддержание генетической стабильности организма. Белки системы MMR взаимодействуют с ДНК-полимеразой и «исправляют ошибки», возникающие при репликации ДНК. К настоящему времени накопилась информация о том, что система MMR сама может выступать источником генетических ошибок. В частности, показано, что белки – компоненты системы MMR – способствуют экспансии повторяющихся участков ДНК. Последовательность нуклеотидных повторов обуславливает формирование неканонических структур ДНК, например, G-квадруплексов. Известно, что MutS из E. coli эффективно связывает ДНК, содержащую квадруплекс. Предполагается отсутствие инициации репарации в такой системе. Однако эта гипотеза не имеет экспериментального подтверждения. Также остается открытым вопрос о влиянии квадруплексов на другие белки системы MMR E. coli, в частности MutL и MutH. На первом этапе с помощью 22- и 41-звенных ДНК были сконструированы модели неканонических форм, фланкированные двойными спиралями. Для моделирования квадруплекса в одну из олигонуклеотидных цепей встраивался d(GGGT)4-мотив, а в цепи, которая гибридизуется с ней, отсутствовала часть, комплементарная квадруплекс-образующей последовательности. Методами УФ-«плавления» и кругового дихроизма было показано, что в дан- ной модели формируется параллельный G-квадруплекс, фланкированный дуплексными участками. На следующем этапе прямым олигонуклеотидным синтезом были получены флуоресцентно-меченные 95- и 76-звенные компоненты для форми- рования серии дуплексов, содержащих сайт расщепления MutH, вставку квадруплексного мотива и G/T-пару. Показано, что для моделирования функциональной ДНК со вставками неканонических форм оптимальным является расстояние в 36 пар нуклеотидов (п.н.) от участка узнавания MutH до G/T-пары и 14 п.н. до конца дуплекса. Концентрация КСl, при которой наблюдался эффективный гидролиз ДНК (60%) под действием MutH (250 нМ) в присутствии белков MutS (250 нМ) и MutL (125 нМ), составляла 125 мМ. Таким образом, были сконструированы синтетические аналоги субстратов, формирующие G-квадруплекс, а также подобраны условия, при которых удается фиксировать инициацию начальных этапов репарации MMR.