ИСТИНА |
Войти в систему Регистрация |
|
ИСТИНА ИНХС РАН |
||
Цитохром с оксидаза (ЦОХ) это мультисубъединичный гем/медный интегральный мембранный белок, катализирующий восстановление кислорода до воды в дыхательной цепи митохондрий и многих бактерий. В ферменте присутствуют два гема (низко-спиновый гем а и высоко-спиновый гем а3) и два медных центра (CuA и CuB). Высоко-спиновый гем а3 и CuB образуют кислород-редуктазный центр, в то время как CuA и гем а служат для проведения электронов от донора (цитохром с) в кислород-редуктазный центр. В ходе 4-х электронного каталитического цикла в кислород-редуктазном центре образуется серия промежуточных состояний. Вслед за присоединением кислорода, происходит мгновенное образование связанной перекиси и ее гетеролитический разрыв с переходом реакции в типичную пероксидазную фазу. При этом промежуточные состояния FI и FII аналогичны компаундам I и II пероксидаз и соответствуют оксоферрильному состоянию гема а3 с максимумами поглощения 607 и 580 нм. Внешний оксилительный эквивалент в состоянии FI по сравнению с FII распологается на радикале ароматического аминокислотного остатка, вероятно тирозина вблизи a3/CuB центра. Каждая из 4-х стадий электронного транспорта, как полагают, сопряжена с электрогенным захватом 1-го протона из внутренней водной фазы в каталитический центр и, дополнительно, с электрогенным переносом 1-го протона изнутри наружу через мембрану. В сотрудничестве с лабораторией Р. Генниса (Иллинойский университет) мы провели разрешенное во времени исследование транслокации зарядов через мембрану, сопряженное с пероксидазной фазой цитохромоксидазной реакции, то есть с переносом на кислород 3-го (FI->FII) и 4-го (FII->O) электронов в каталитическом цикле. Использовалась одноэлектронная светоиндуцированная инъекция электронов в цитохромоксидазу от комплекса Ru (II). Сравнивались фотоэлектрические ответы цитохромоксидазы из бычьих митохондрий и цитохромоксидазы из Rhodobacter sphaeroides (как дикого типа, так и мутантов по протонным каналам). Каждый из переходов цитохромоксидазы (FI->FII и FII->O) состоит по крайней мере из 3 электрогенных стадий, обозначаемых как "быстрая", "средняя" и "медленная". "Быстрая" фаза (15-45 мкс) относится к векторному переносу электрона от фотовосстановленного входного редокс-центра CuA к низко-спиновому гему а на расстояние 1/3 мембранной толщины. "Средняя" и "медленная" фазы (0.5 – 5 мс) соответствуют электрогенному протонному транспорту, сопряженному термодинамически с редокс-превращениями в кислород-редуктазном центре. Две протонные фазы имеют примерно одинаковую амплитуду, близкую к транслокации одного элементарного заряда на расстояние 80-100% мембранной толщины. Для обоих переходов цитохромоксидазы превращение кислородного интермедиата гема а3, регистрируемое с помощью спектроскопии поглощения, совпадает по скорости с первой из двух протонных электрогенных фаз ("средней"). В тоже время вторая протонная фаза ("медленная") происходит после завершения химической реакции в каталитическом центре. Данная фаза может отражать транслокацию протона, вызванную релаксацией в белке "напряженной" конформации окрестности a3/CuB центра, возникшей в ходе предшествующей редокс-реакции.