ИСТИНА

За последние 20 лет большое распространение получили методы высокоэффективной жидкостной хроматографии, совмещенные с тандемной масс-спектрометрией (ВЭЖХ-МС/МС). Данные методы потенциально позволят решить огромное количество практических задач в диагностике. Благодаря высокой специфичности, ВЭЖХ-МС/МС, вероятно, могла бы составить конкуренцию таким аналитическим инструментам, как методы на основе иммуноанализа. ВЭЖХ-МС/МС признан исследовательским сообществом как золотой стандарт, поэтому исследователями принято использовать его для выполнения серьезных научных программ и при подготовке публикаций. В результате, например, в базе данных PubMed за последние 20 лет количество публикаций в год с участием данного метода выросло почти в 15 раз. Однако, по мере накопления данных, серьезным вопросом для лабораторий стал вопрос правильной стандартизации методов ВЭЖХ-МС/МС. Из-за того, что лаборатории могут использовать разные методы и оборудование (системы ионизации, газостолкновительные камеры, процедуры очистки образцов, хроматографические колонки, калибраторы и внутренние стандарты), очень трудно добиться надлежащей стандартизации результатов ВЭЖХ-МС/МС. Несмотря на общепринятую последовательность действий при проведении таких исследований, добиться воспроизведения результатов измерений для реальных биологических смесей удается в крайне редких случаях. Вследствие отсутствия стандартизации, становится проблематично контролировать собственные лабораторные результаты, которые могут меняться из года в год, а также обеспечивать преемственность между разными лабораториями, поскольку две лаборатории, выполняющие одно и то же измерение, могут получить разные результаты. Для клинической лаборатории отсутствие стандартизации может сказаться не просто на результатах измерений, это может привести к неправильному диагнозу и, в конечном итоге, неправильному лечению. Стандартные системы ВЭЖХ-МС/МС были разработаны для исследовательской лаборатории, поэтому они легко настраиваются и отлично подходят для разработки методов. Однако клинические лаборатории нуждаются в специализированной системе, которая не только выдает результат, но также способствует его стандартизации. Отсутствие такой системы стало серьезным препятствием для внедрения ВЭЖХ-МС/МС. Одним из перспективных применений ВЭЖХ-МС/МС для дифференциальной диагностики заболеваний легочной системы человека является анализ белкового и пептидного состава конденсата выдыхаемого воздуха (КВВ). Будучи неинвазивной, а, следовательно, легкой в проведении процедурой, такая проба дыхания, как КВВ, позволяет клиницистам и исследователям оценивать различные процессы, происходящие в организме человека. Сбор КВВ может быть осуществлен даже для очень тяжелых пациентов и повторен через короткие промежутки времени. Считается, что исследование КВВ могло бы стать идеальным кандидатом для скрининговых программ. Однако, следующие особенности КВВ делают его крайне сложным объектом для исследования и стандартизации всех процедур при проведении протеомного анализа: – КВВ – сложная многокомпонентная смесь, содержащая большое количество различных пептидов, а также липиды, соли; – концентрация белка находится на пределе чувствительности метода, при этом попытки концентрирования приводят к потерям, нивелирующим плюсы этой процедуры; – белки в респираторном тракте подвергаются действию различных протеаз и в КВВ попадают в виде фрагментов, при этом количество фрагментов и их набор постоянно варьируется и часто покрытие последовательности не превышает 5-10%; – низкая концентрация белка и сложность определения увеличивают ошибку, которую могут вносить загрязнение, различие методов пробоподготовки, сбора и анализа; – не публикуются исходные масс-спектры и полный список идентифицированных пептидов, поэтому нет возможности сопоставить данные; – количество пептидов, которые специализированные программы идентифицируют и соотносят с белками, в среднем, составляет около 10% от общего количества идентифицируемых по данным МС/МС измерений пептидов. Вышеперечисленные трудности и возможные ошибки белковых идентификаций дополняются тем, что белковые находки в рамках протеомного подхода невозможно проверить другими методами, например иммуноферментным анализом (в силу фрагментированности белков и малой представленности последовательностей, а также большого количества фрагментов, принадлежащих разным белкам). В результате, выводы исследований становятся слишком спекулятивными, а единственный однозначный вывод по теме делается о невозможности стандартизации методики. Как можно видеть из графиков публикационной активности по теме, с 2013 года наблюдается снижение, т.е. тема в данный момент не развивается или развивается слабо. Количество статей по протеомному подходу к данному объекту ничтожно мало. На основании анализа опубликованных данных и данных, представленных в данном исследовании, можно прийти к выводу, что «застой» в несомненно перспективном направлении обусловлен двумя причинами: особенностями объекта и отсутствием стандартизации.