ИСТИНА

Эховирусы являются группой (+)РНК-содержащих вирусов, относящихся к роду Enterovirus семейства Picornaviridae. Многие из них – возбудители разнообразных заболеваний, в том числе детских [1]. Для трансляции своих мРНК эховирусы используют IRES-элементы (англ. internal ribosome entry site) - высокоструктурированные участки мРНК, находящиеся в 5′-нетранслируемых областях и отвечающие за связывание факторов инициации и рибосом [2]. Однако молекулярные механизмы, лежащие в основе синтеза белков эховирусов, изучены крайне слабо. Для поиска генов человека, задействованных в жизненном цикле эховирусов, мы провели CRISPR/Cas-опосредованный генетический скрининг на устойчивость культивируемых клеток к цитопатической эховирусной инфекции. Клетки эмбриональной почки человека HEK293Т, трансдуцированные полногеномной лентивирусной CRISPR-библиотекой GeCKO v2, заражали эховирусами Echo 6, Echo 11, Echo19 и Echo 30. Немногочисленные клетки, выжившие после заражения, размножили, затем выделили из них ДНК, амплифицировали кассеты с генами гидовых РНК и просеквенировали их на платформе Illumina. Одним из генов, нокаут которого позволял клеткам выживать при заражении эховирусами, оказался ген MBNL1 (Muscleblind Like Splicing Regulator 1), который кодирует РНК-связывающий белок, участвующий в альтернативном сплайсинге мРНК. Ранее было показано, что белок MBNL1 является партнёром другого регулятора сплайсинга, белка PTBP1 [3], хорошо известного в качестве ITAF (англ. IRES trans-acting factor) - фактора, необходимого для работы пикорнавирусных IRES-элементов [2]. Исходя из этого, было выдвинуто предположение, что MBNL1 участвует в IRES-опосредованной инициации трансляции мРНК эховирусов. Для проверки гипотезы с помощью технологии CRISPR/Cas была получена моноклональная линия клеток HEK293T с нокаутом гена MBNL1. Отсутствие соответствующего белкового продукта было подтверждено Вестерн-блот-гибридизацией. Полученную моноклональную линию, а также исходные клетки HEK293T заражали разными энтеровирусами и оценивали динамику развития цитопатического эффекта. Вирусы CVA16, CVA9, Echo6, Echo7, Echo14, Echo19 и Echo30 вызывали гибель культуры нокаутированных клеток лишь спустя 3-4 дня после заражения, а вирус CVA9 и вовсе не оказывал на них цитопатического действия, хотя в случае клеток «дикого типа» все эти вирусы вызывали гибель культуры в течение суток. Для выяснения роли белка MBNL1 в IRES-опосредованной трансляции были созданы репортерные конструкции с геном люциферазы светлячка под контролем IRES-элементов эховирусов Echo6 и Echo11. Трансляция искусственно синтезированных мРНК, полученных с этих конструкций, была проанализирована в клетках с нокаутом гена MBNL1 и в клетках «дикого типа». В докладе будут представлены данные о роли белка MBNL1 в жизненном цикле эховирусов. 1. Lee et al. J. Clin. Virol. 2010, 49, 175-179. 2. Sorokin et al. Biochemistry (Moscow), 2021, 86, 1060–1094. 3. Gooding et al. Nucleic Acids Res. 2013, 41, 4765–4782.