ИСТИНА

Биотехнологический синтез стероидных соединений имеет ряд преимуществ перед химическим способом. В связи с этим растет интерес к созданию рекомбинантных микроорганизмов, способных к эффективной биотрансформации стероидов. Показано, что энзиматическая система цитохрома P450scc млекопитающих, осуществляющая трансформацию холестерина в прегненолон (предшественник стероидных гормонов), проявляет функциональную активность в клетках микроорганизмов. Однако уровень содержания образующегося прегненолона недостаточен для их использования в биотехнологической промышленности. Лимитирующий стадией является транспорт холестерина к месту локализации P450scc-системы в клетке микроорганизма. Для решения данной проблемы использованы разные подходы – применение детергентов, пермеабилизаторов, синтез эндогенного субстрата и поиск наиболее подходящих микроорганизмов. Однако это не привело к созданию высокоэффективных биотехнологических процессов синтеза прегненолона. В данной работе тестирована возможность использования белка-переносчика холестерина человека STARD1 для повышения эффективности транспорта стероидных субстратов в клетку бактерий. Получены плазмиды pET22/STARD1 и pET22/STARD1-GFP, несущие кДНК, кодирующие функциональный домен белка STARD1(53-285 а.к.) или слитой белок STARD1-GFP с N-концевой последовательностью pelB, адресующей белки в периплазму. При анализе рекомбинантных клеток E. coli BL21(DE3), трансформированных pET22/STARD1-GFP, методом флуориметрии наблюдается ожидаемый для репортерного белка GFP пик испускания (509 нм), что указывает на правильную конформацию STARD1- GFP в клетках. Western Blot анализ показал, что синтезирующийся в клетках STARD1-GFP в основном стабилен, обнаружено лишь незначительное количество меньшего по размеру иммуноспецифичного белка. STARD1 способен увеличивать содержание внутриклеточного холестерина (показано с использованием ВЭЖХ-МС) и его флуоресцентного аналога 22-NBD- гидроксихолестерина (показано с использованием флуоресцентной спектроскопии) в клетках бактерий E. coli/pET22/STARD1 в 1,5 и 2 раза соответственно в сравнении с контрольным штаммом. Таким образом, впервые показано, что переносчик холестерина STARD1 способен проявлять функциональную активность в гетерологичных клетках. Полученные данные указывают на то, что использование белков-переносчиков для более эффективной доставки в клетки холестерина и повышения уровня его трансформации реконструированной в клетках P450scc-системой является перспективным. Работа выполнена при поддержке гранта РФФИ No 20-08-00467А.