ИСТИНА |
Войти в систему Регистрация |
|
ИСТИНА ИНХС РАН |
||
Фермент простагландин-H-синтаза (также называемый циклооксигеназой, далее PGHS) играет важную роль в функционировании организма млекопитающих. Две изоформы (PGHS-1 и PGHS-2) участвуют в поддержании тонуса гладкой мускулатуры, регуляции свёртывания крови, развитии воспаления и других процессах. Фермент существует в виде гомодимера, локализован на мембранах ЭПР и ядра и катализирует две реакции: специфическую – циклооксигеназную и неспецифическую – пероксидазную, причём реакции взаимосвязаны [1,2,3]. Основной интерес к PGHS с точки зрения фармакологии заключается в том, что ингибиторы её циклооксигеназной активности являются нестероидными противовоспалительными препаратами. Ингибиторы обладают разной селективностью по отношению к изоформам фермента, а также различными побочными эффектами. Во времена открытия PGHS различали необратимые (аспирин и производные) [4] и обратимые конкурентные ингибиторы. В дальнейшем было показано, что некоторые обратимые ингибиторы являются времязависимыми, и была предложена кинетическая схема их действия [5,6]. Мы выбрали для исследований напроксен, широко известный как конкурентный ингибитор, для которого не было сведений о времязависимом связывании. Однако в эксперименте было показано обратное. Кинетическая схема, отражающая реакцию в присутствии времязависимого ингибитора, не может быть описана целиком в рамках квазистационарного или квазиравновесного приближения. Мы предположили (и в дальнейшем подтвердили правомерность такого предположения), что характеристическое время достижения квазистационара в реакции с субстратом много меньше, чем время достижения равновесия в реакции с ингибитором. Это позволило разделить схему на два участка: связывание фермента с ингибитором и реакция фермента с субстратом. Связывание фермента и ингибитора после их смешивания можно рассматривать в предстационарном режиме. При последующем добавлении субстрата можно считать, что концентрация фермент-ингибиторного комплекса меняется пренебрежимо мало за время достижения стационарного по субстрату режима, и применять стационарное приближение, учитывая только не связанный с ингибитором фермент. Таким образом, скорость реакции в начальный момент времени после добавления субстрата пропорциональна концентрации активного (свободного от ингибитора) фермента и практически не зависит от концентрации ингибитора. Эксперимент ставился следующим образом. В буферный раствор добавляли PGHS и напроксен и прединкубировали некоторое время. Далее добавляли субстрат (арахидоновую кислоту) и детектировали скорость поглощения кислорода в процессе реакции. Зависимость начальной скорости реакции от времени прединкубации белка с ингибитором мы приблизили согласно рассчитанному в предстационарном режиме уравнению E+I⇄EI (рис.1). По полученным графикам вычислили равновесную при данной концентрации ингибитора концентрацию активного белка. Мы построили зависимость этой концентрации от концентрации ингибитора (рис.2) и показали, что эта зависимость не описывается простейшей схемой ингибирования (R2=0,944), приведенной выше, а также схемой E+I⇄EI⇄E*I, приведённой в работе [5] для ингибиторов индометацина и флурбипрофена. Мы предложили другую схему: EE+I⇄EIE, EIE+I⇄EIEI. Она описала зависимость существенно лучше (R2=0,999). В этом случае равновесная константа связывания первой молекулы ингибитора оказалась равной 54±7 нМ, второй молекулы – 7,2±3,4 мкМ. Скорость реакции с субстратом формы EIE составила 20% ± 3% от скорости для EE (реакция для IEIE отсутствовала). Такая схема описывает аллостерический эффект ингибитора. Эта схема также может описывать случай связывания ферментом одной молекулы ингибитора неконкурентно с низкой константой и одной – конкурентно с более высокой, при значительном различии констант. Для определения того, какой из этих механизмов является правильным, требуются дальнейшие исследования. Рис.1. Зависимость скорости реакции после добавления субстрата от времени прединкубации фермента с напроксеном перед добавлением субстрата. Рис.2. Зависимость равновесной скорости от концентрации напроксена и приближение этой зависимости согласно кинетическим схемам Литература 1. Tsai AL, Kulmacz RJ. Prostaglandin H synthase: resolved and unresolved mechanistic issues // Arch Biochem Biophys. 2010 Jan 1;493(1):103-24. 2. Rouzer CA, Marnett LJ. Mechanism of free radical oxygenation of polyunsaturated fatty acids by cyclooxygenases // Chem Rev. 2003 Jun;103(6):2239-304. 3. Smith WL, DeWitt DL, Garavito RM. Cyclooxygenases: structural, cellular, and molecular biology // Annu Rev Biochem. 2000;69:145-82. 4. Roth GJ, Stanford N, Majerus PW. Acetylation of prostaglandin synthase by aspirin // Proc Natl Acad Sci USA. 1975 Aug;72(8):3073-6. 5. Callan OH, So OY, Swinney DC. The kinetic factors that determine the affinity and selectivity for slow binding inhibition of human prostaglandin H synthase 1 and 2 by indomethacin and flurbiprofen. J Biol Chem. 1996 Feb 16;271(7):3548-54. 6. So OY, Scarafia LE, Mak AY, Callan OH, Swinney DC. The dynamics of prostaglandin H synthases. Studies with prostaglandin h synthase 2 Y355F unmask mechanisms of time-dependent inhibition and allosteric activation. J Biol Chem. 1998 Mar 6;273(10):5801-7.