ИСТИНА

Вопрос о том, как белки в процессе фолдинга принимают нативное, функционально активное состояние является одним из ключевых в молекулярной биологии. Современная теория фолдинга белков, наглядно представленная в модели энергетической поверхности, объясняет формирование высокоорганизованного, компактного нативного состояния глобулярных белков, образование олигомеров, аморфных агрегатов и амилоидных фибрилл [1, 2]. Однако несмотря на прогресс в понимании фолдинга белков, наши представления о сворачивании белков, в том числе обладающих топологией β-бочонка, ограничены. Белки большой группы одорант-связывающих белков (OBP), принадлежащие семейству липокалинов, имеют структуру β-бочонка. Классический OBP имеет мономерную укладку полипептидной цепи. Его бочонок образован из 8-ми β-ветвей, короткого α-спирального участка, за которым следует 9-ая β-ветвь бочонка и неупорядоченный C-концевой участок белка [5, 6] . Внутренняя полость OBP сформирована преимущественно гидрофобными и ароматическими аминокислотными остатками и служит для связывания лиганда. Белки этой группы привлекают интерес в качестве перспективного объекта для создания чувствительного элемента биосенсорных систем для обнаружения опасных, в том числе взрывчатых и токсичных веществ, работающих в режиме реального времени [3]. Это связано с тем, что OBP обладают высокой структурной пластичностью лиганд-связывающего центра, позволяющего настраивать его на взаимодействие с лигандом, структурно отличающимся от природных лигандов белка [3, 4]. В отличие от большинства OBP, имеющих классическую мономерную укладку, бычий одорант-связывающий белок (bOBP) имеет уникальную димерную укладку [6]. Каждая мономерная субъединица bOBP имеет классическую для OBP укладку. При образовании димерной молекулы α-спираль каждой из мономерных субъединиц взаимодействует с β-бочонком другой. Данный способ формирования димерных и олигомерных белковых комплексов носит название «обмена доменами». В настоящее время механизм «обмена доменами» известен для многих белков и играет важную структурную и функциональную роль [7, 8]. Считается, что «обмен доменами» влияет на стабильность белка в целом посредством увеличения площади взаимодействия между субъединицами [9, 10]. В некоторых случаях формирование четвертичной структуры таким способом приводит к проявлению новых свойств у белковых олигомеров, не наблюдаемых у мономерных форм. [9]. Механизм олигомеризации посредством «обмена доменами» также задействован на ранних этапах формирования амилоидных фибрилл [8]. Ранее в нашей лаборатории было проведено исследование процессов фолдинга белков с топологией β-бочонка на примере рекомбинантного bOBP. Было показано, что рекомбинантный bOBP, в отличие от bOBP, выделенного из ткани, существует в стабильном нативо-подобном состоянии со сниженной тенденцией к димеризации и накапливается в виде смеси мономерных и димерных форм белка [13]. Было показано, что в нативное димерное состояние белок переходит под действием значительной концентрации денатурирующего агента (1,5 М в случае использования гуанидингидрохлорида (GdnHCl)). Для этого процесса требуется реорганизация структуры белка, было обнаружено соответствующее стабильное более компактное промежуточное состояние белка (0,5 М GdnHCl). В данной работе было проведено более подробное исследование процессов фолдинга белков с топологией β-бочонка на примере двух мономерных мутантных форм рекомбинантного bOBP [11, 12], исследовано влияние механизма «обмена доменами» на стабильность и процессы сворачивания-разворачивания рекомбинантного bOBP. Изучено влияние присутствия природного лиганда 1-октен-3-ола (OCT) на процессы фолдинга рекомбинантного bOBP и двух его мономерных мутантных форм. Введение глицина после остатка 121 приводит к образованию мономерной мутантной формы bOBP-Gly-121+. Считается, что это происходит за счет увеличения подвижности петлевого участка, связывающего 8-ю β-ветвь бочонка и α-спираль, что позволяет восстановить взаимодействие α-спирали мономера с собственным β-бочонком. Введение аминокислотных замен Trp 64 и His 156 на цистеиновые в bOBP-Gly121+ приводит к восстановлению классической для OBP дисульфидной связи и образованию мономерной мутантной формы GCC-bOBP. Исследование процессов фолдинга мономерных мутантных форм bOBP было выполнено с использованием методов собственной флуоресценции белков, КД в дальней УФ-области, гельфильтрации и флуоресценции гидрофобного красителя АНС. Было показано, что мономерная мутантная форма bOBP-Gly-121+ уже при небольших концентрациях денатурирующего агента переходит в стабильное промежуточное состояние, которое соответствует промежуточному состоянию, обнаруженному при исследовании денатурации рекомбинантного bOBP. Это состояние более компактно, способно связывать краситель АНС. Дальнейшее увеличение концентрации денатурирующего агента приводит к образованию более рыхлого промежуточного состояния и дальнейшей денатурации белка. При этом область перехода практически совпадает с переходом рекомбинантного bOBP. Процесс денатурации полностью обратим. Образование комплекса bOBP-Gly121+ с лигандом приводит к существенной стабилизации белка, однако связывание лиганда не меняет путь разворачивания белка. Исследование кривых денатурации-ренатурации мутантной формы GCC-bOBP свидетельствует о том, что процесс денатурации полностью обратим и проходит с образованием тех же промежуточных состояний, что были обнаружены при исследовании процесса разворачивания рекомбинантного bOBP и bOBP-Gly121+. Однако формирование компактного промежуточного состояния, способного связывать АНС происходит при больших концентрациях денатурирующего агента (1 М GdnHCl), а также вся кривая денатурации сдвинута в область больших концентраций GdnHCl, что свидетельствует о большей стабильности белка по сравнению с рекомбинантным bOBP и bOBP-Gly121+. Связывание лиганда приводит к сдвигу кривой разворачивания белка в область больших концентраций денатурирующего агента, что свидетельствует о стабилизации структуры при взаимодействии с лигандом, однако связывание лиганда не меняет путь денатурации белка. Исследование кривых денатурации-ренатурации рекомбинантного bOBP в присутствии лиганда показывает, что процесс денатурации проходит с образованием тех же промежуточных состояний, которые были обнаружены для рекомбинантного bOBP. Однако для bOBP/OCT эти состояния накапливаются при больших концентрациях денатурирующего агента. Также сам переход в развернутое состояние сдвинут в область больших концентраций денатурирующего агента. Это свидетельствует о стабилизирующем влиянии связывания лиганда. Однако в отличие от мономерных мутантных форм, ренатурация рекомбинантного bOBP не является необратимой. Полная обратимость достигается только в области 2 М GdnHCl, что соответствует промежуточному состоянию, в котором образуется нативный димерный белок. С помощью гель-фильтрации показано, что при меньших концентрациях GdnHCl белок находится преимущественно в мономерной форме. При связывании лиганда промежуточное состояние существенно слабее связывает АНС, однако способность связывать краситель сохраняется. Напротив, показано, что при связывании лиганда мономерные формы теряют способность связывать АНС. Это позволяет сделать вывод о том, что участки связывания АНС смежные и/или совпадают с участками связывания лиганда. Это подтверждает наличие дополнительного сайта связывания лиганда у димера bOBP. В ходе работы было показано, что рекомбинантный bOBP и его мономерные мутантные формы bOBP-Gly121+ и GCC-bOBP имеют одинаковые пути денатурации, которые не зависят от олигомерного статуса белков, то есть информация о пути сворачивания-разворачивания закодирована в аминокислотной последовательности. При этом денатурация мономерных форм является обратимой, а денатурация bOBP существенно осложнена процессом димеризации по механизму «обмена доменами», который не является полностью обратимым. Показано, что GCC-bOBP является более стабильным, чем bOBP и bOBP-Gly121+, которые являются примерно одинаково стабильными. Это показывает, что димеризация посредством механизма «обмена доменами» не вносит вклад в увеличение стабильности белка. Образование дисульфидной связи напротив приводит к существенной стабилизации структуры белка. Связывание лиганда приводит к увеличению стабильности всех белков, при этом не происходит изменения пути сворачивания-разворачивания.