ИСТИНА

Белки, изменяющие свою конформацию при взаимодействии с аналитом, присутствие и концентрацию которого желательно определить в анализируемой среде, могут использоваться для конструирования биосенсорных систем. К таким белкам можно в первую очередь отнести лиганд-связывающие белки периплазмы бактерий. При связывании D-галактоза/D-глюкоза-связывающего белка (GGBP) из E.coli с глюкозой наблюдаются значительные перестройки его пространственной структуры, что делает этот белок перспективным кандидатом на роль чувствительного элемента биосенсорной системы для непрерывного определения глюкозы в крови пациентов, больных диабетом. Константа диссоциации комплекса GGBP с сахаром очень низка (1мкМ). Это означает, что белок дикого типа (GGBPwt) может быть использован в биосенсорной системе на глюкозу лишь в сочетании с трансдермальными методами экстракции сахара из крови или межклеточных жидкостей, сопряженными с существенным разбавлением глюкозы. Для использования GGBP в качестве чувствительного элемента биосенсорной системы на глюкозу для определения ее концентрации непосредственно в крови необходимо создать мутантную форму белка с существенно более низкой константой связывания глюкозы. При создании мутантных форм белков с заданными характеристиками следует учитывать, что введение мутации в первичную последовательность белка может привести к нарушению функциональной активности белка, его структуры и стабильности. В настоящей работе мы исследовали GGBPwt и его две мутантные формы, содержащие аминокислотные замены в активном центре – GGBP-W183A и GGBP-F16A. Установлено, что оба белка сохраняют нативную глобулярную структуру, присущую GGBPwt, и способность связывать лиганд. Константа диссоциации обоих мутантных белков с глюкозой существенно выше, чем для GGBPwt. Чтобы охарактеризовать стабильность мутантных форм GGBP и GGBPwt, мы исследовали денатурацию этих белков под действием гуанидингидрохлорида (GdnHCl) и нагревания. Разворачивание GGBPwt, GGBP-W183A и GGBP-F16A под действием GdnHCl является обратимым одностадийным процессом. Денатурационный переход для мутантных форм GGBP сдвинут в область меньших концентраций денатуранта по сравнению с GGBPwt, что свидетельствует о дестабилизирующем действии замен W183A и F16A на структуру белка в целом. При этом мутантная форма GGBP-W183A более устойчива к действию GdnHCl, чем GGBP-F16A. При изучении тепловой денатурации белков был обнаружен более сложный характер их разворачивания. Замены W183A и F16A оказывают различное воздействие на стабильность белка в целом. Показано, что N- и C-концевой домены GGBP-W183A имеют разную и более низкую стабильность по сравнению с белком GGBPwt. В присутствии глюкозы GGBP-W183A становиться более стабильным к нагреванию. Другой белок GGBP-F16A обладает очень ограниченной стабильностью, как в отсутствие, так и в присутствии лиганда. Это свидетельствует о том, что Phe 16 необходим для поддержания стабильности белка. На основании всех данных, мы предполагаем, что GGBP-W183A является более перспективным белком в качестве чувствительного элемента биосенсора на глюкозу.