ИСТИНА

Исследование белков большой группы одорант-связывающих белков (OBP), имеющих структуру типа β-бочонка, актуально для разрешения одного из ключевых вопросов молекулярной биологии о том, как белки приобретают в процессе фолдинга нативное, функционально активное состояние [1, 2]. Несмотря на прогресс в понимании фолдинга белков, наши представления о сворачивании белков с топологией типа β-бочонка ограничены. Белки этой группы представляют интерес, как перспективный объект для конструирования оптических биосенсорных систем на опасные, в том числе взрывчатые и токсичные вещества [3]. Это связано с тем, что OBP обладают высокой структурной пластичностью лиганд-связывающего центра, позволяющего настраивать его на взаимодействие с лигандом, структурно отличающимся от природных лигандов белка [3, 4]. Классический OBP характеризуется мономерной укладкой полипептидной цепи. Его β-бочонок OBP образован из восьми β-ветвей, короткого α-спирального участка, за которым следуют 9-ая β-ветвь бочонка и неупорядоченный С-концевой участок белка [5, 6]. Сайт связывания лиганда сформирован гидрофобными и ароматическими остатками, принадлежащими внутренней полости β-бочонка и отдельным петлевым участкам, связывающим β-ветви бочонка. В отличие от большинства OBP, имеющих классическую мономерную укладку, бычий одорант-связывающий белок (bOBP) имеет уникальную димерную укладку [6]. Каждая мономерная субъединица bOBP формирует классическую для OBP укладку при взаимодействии его β-бочонка с α-спиральным участком другой мономерной субъединицы посредством механизма «обмена доменами». Такой способ формирования димерных и олигомерных белковых комплексов в настоящее время известен для многих белков и играет важную структурную и функциональную роль [7, 8]. Полагают, что увеличение площади взаимодействия между субъединицами белка при «обмене доменами» влияет на стабильность белка в целом [9, 10]. В ряде случаев формирование четвертичной структуры белка с помощью «обмена доменов» сопряжено с возникновением новых функций у белковых олигомеров, не характерных для мономерных форм этих белков [9]. Механизм олигомеризации посредством «обмена доменами» так же задействован на ранних этапах формирования амилоидных фибрилл [8]. Для выявления свойств bOBP, определяющих формирование его уникальной димерной структуры, и роли механизма «обмена доменов» в поддержании нативной структуры белка необходимо выполнить сравнительное исследование структуры bOBP и его мономерных форм. В настоящей работе мы исследовали структурные особенности рекомбинантного bOBP и двух его мутантных форм, не склонных к димеризации посредством «обмена доменов» [11, 12] используя методы собственной флуоресценции белков, КД в дальней и ближней УФ-областях и гельфильтрации. Введение глицина после остатка 121 в bOBP должно приводить к формированию мономерной укладки полипептидной цепи bOBP-Gly121+ за счет увеличения подвижности петлевого участка, связывающего α-спираль и 8-ую β-ветвь бочонка. Введение аминокислотных замен остатков Trp 64 и His 156 на цистеиновые остатки в bOBP-Gly121+ (мутантная форма GCC-bOBP) должно приводить к формированию более стабильной укладки этой мономерной формы белка за счет восстановления канонической для OBP дисульфидной связи. Исследование мутантных форм GCC-bOBP-W17F и GCC-bOBP-W133F, содержащих по одному триптофановому остатку, позволило выявить неизвестные ранее особенности микроокружения триптофанового остатка, которые могут оказывать влияние на флуоресцентные характеристики белка. Ранее в нашей лаборатории было показано, что рекомбинантный bOBP, в отличие от bOBP, выделенного из ткани, существует в стабильном нативо-подобном состоянии со сниженной тенденцией к димеризации и накапливается в виде смеси мономерных и димерных форм белка [13] (Рис. 1). В нативное димерное состояние рекомбинантный bOBP переходит при значительном увеличении концентрации денатурирующего агента (до 1,5 М в случае использования гуанидингидрохлорида). Этот процесс требует реорганизации структуры bOBP и протекает с образованием стабильного, более компактного, промежуточного состояния. Методом гельфильтрации было показано, что все исследуемые мутантные формы bOBP имеют мономерную укладку полипептидной цепи (Рис. 1). Однако, мономеры мутантных форм bOBP имеют более рыхлую структуру, по сравнению с рекомбинантным bOBP. Все мутантные формы bOBP в целом сохраняют вторичную и третичную структуру, сходную со структурой рекомбинантного bOBP. При этом структура GCC-bOBP наиболее близка к структуре рекомбинантного bOBP. Наблюдаемые локальные изменения структуры мутантных форм bOBP не нарушают способности белков связывать лиганд, что было выявлено в экспериментах по взаимодействию мутантных белков с флуоресцентным лигандом аминоантраценом-1. Связывание лиганда с мутантными формами bOBP приводит к формированию более компактного мономерного состояния белка. При исследовании флуоресцентных характеристик GCC-bOBP и его мутантных форм с одним триптофановым остатком GCC-bOBP-W17F и GCC-bOBP-W133F было показано, что остаток Trp 17 существенно затушен входящим в состав его микроокружения остатком Lys 121, ориентированным параллельно индольному кольцу триптофанового остатка [14] (Рис. 2). Однако, остаток Trp 64, имеющий в своем микроокружении остаток Lys 59 в такой же конформации, вносит существенный вклад в суммарную флуоресценцию bOBP. Мы полагаем, это связано с тем, что прямое взаимодействие атома азота Lys 59 с индольным кольцом Trp 64 экранировано молекулой воды, непосредственно контактирующей с атомом азота индольного кольца Trp 64 (Рис. 2). Показано, что вставка Gly121+ приводит к нарушению механизма «обмена доменов», в результате чего формируется стабильное мономерное состояние мутантного белка bOBP-Gly121+. Введение дисульфидной связи необходимо для стабилизации мономерной укладки GCC-bOBP. Исследуемые аминокислотные замены, такие как вставка Gly121+ в bOBP-Gly121+, замены Trp 64 и His 156 на цистеиновые остатки в GCC-bOBP, и замены Trp 17 и Trp 133 на фенилаланин в GCC-bOBP-W17F и GCC-bOBP-W133F, не нарушают функциональную активность мутантных белков. Выявлены особенности микроокружения триптофановых остатков белка, существенные для формирования флуоресцентных свойств белков, на которые ранее не обращали внимания.