ИСТИНА

Для сложных полимерных субстратов давно известна важность характера адсорбции фермента, которая может быть или продуктивной, предшествующей каталитической стадии процесса, или непродуктивной, блокирующей действие фермента. В последние два десятилетия обнаружились новые аспекты, связанные с особой формой устойчивости бактерий к действию антибактериальных факторов иммунной системы. Выявляются всё новые молекулярные структуры поверхности бактериальных клеток, способные целенаправленно связывать антибактериальный фермент лизоцим, тем самым блокируя механизмы дезинтеграции бактерий при их поглощении иммунной клеткой фагоцитом, что соответственно блокирует как процесс обезвреживания бактерии, так и последующую презентацию бактериальных антигенов, необходимую образования специфических антител. В данной работе проводилось исследование параметров адсорбции фермента лизоцима непосредственно на живых целых бактериальных клетках в условиях протекания ферментативного лизиса (разрушения) бактерий. В качестве модельного фермента использовался лизоцим куриного яйца, который в настоящее время применяется в составе медицинских препаратов и который имеет сходную структуру с лизоцимом человека. В качестве бактерий исследовали грамотрицательные бактерии Escherichia coli семейства Enterobacteriaceae, грамположительные спорообразующие бактерии Bacillus subtilis семейства Bacillaceae и грамположительные Lactobacillus plantarum семейства Lactobacillaceae. Было показано, что адсорбция лизоцима имеет обратимый характер, а равновесие устанавливается менее чем за 3-5 мин при температуре 37 °C. После установления равновесия изотермы адсорбции во всех случаях удовлетворительно аппроксимируются уравнением Ленгмюра. Анализ экспериментальных данных не выявил одновременного наличия разных центров связывания лизоцима на бактериальных клетках, для которых существенно отличаются равновесные параметры адсорбции. При разной доле лизированных клеток после инкубации смеси бактерий с лизоцимом в течение 5 минут и 20 минут сорбционные характеристики не меняются в пределах погрешности, таким образом, характер адсорбции лизоцима на целых клетках и на обломках клеток одинаковый. Адсорбционная ёмкость это максимальное количество связываемого клетками лизоцима в данных условиях, Amax. Amax уменьшается при повышении и понижении значения pH от оптимума активности. Amax составляет от 2.7·10^7 до 1.5·10^8 молекул лизоцима на одну клетку в зависимости от вида бактерий. В случае клеток бактерий E. coli и B. subtilis обнаружено двукратное снижение скорости ферментативного лизиса клеток (VL) при уменьшении ионной силы раствора в диапазоне 80 мМ – 5 мМ. Изучение кинетических параметров показало, что снижение скорости лизиса клеток происходит за счёт увеличения константы Михаэлиса (Км) при неизменности максимальной скорости лизиса клеток (Vmax). Было выяснено, что при снижении ионной силы уменьшается константа десорбции лизоцима (Кd) при неизменности Amax. Кd уменьшается до 10 раз для E.coli до 1.2·10^-7 М. Кd уменьшается до 3 раз для В. subtilis до 2.4·10^-7 М. Можно предположить увеличение вклада непродуктивной сорбции лизоцима на бактериях E. coli и B. subtilis при понижении ионной силы. В случае клеток L. plantarum при изменении ионной силы раствора в диапазоне 80 мМ – 5 мМ не происходит драматических изменений параметров адсорбции лизоцима и VL. В случае E. coli наблюдается увеличение VL в 1.5-2.0 раза в присутствии свободных аминокислот глицина, гистидина и заряженных аминокислот (Gly, His, Asp, Glu, Arg, Lys) в концентрации 1-5 мМ. В присутствии этих аминокислот Amax не меняется, а Кd уменьшается. Таким образом, активирующие ферментативный лизис добавки, вероятно, увеличивают вклад продуктивной сорбции. Бактериальные инфекции семейств Enterobacteriaceae и Bacillaceae (например, брюшной тиф, сальмонеллёз, бактериальная дизентерия, сибирская язва) особенно опасны тем, что эти бактерии потенциально могут связывать лизоцим фагоцитирующих иммунных клеток и использовать фагоциты в качестве контейнеров для распространения бактерий по организму. Поэтому новая информация об эффекторах, препятствующих непродуктивной адсорбции лизоцима, особенно важна для разработки новых антибактериальных лекарственных препаратов. Работа выполнена на кафедре химической энзимологии химического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова в рамках государственного задания «Молекулярный дизайн, структурно-функциональный анализ и регуляция ферментных систем, клеточных конструкций, бионаноматериалов: фундаментальные основы и приложения в технологии, медицине, охране окружающей среды» Номер ЦИТИС: 121041500039-8.