ИСТИНА

ЭФР-рецепторная система отвечает за пролиферацию, дифференцировку, выживание при апоптозе и клеточную подвижность. После связывания рецептора ЭФР с лигандом происходит стимуляция сигнальных каскадов и эндоцитоз ЭФР-рецепторных комплексов. В ходе этого процесса ЭФР-рецепторные комплексы попадают в ранние сортирующие эндосомы, откуда рецептор может рециклировать или попадать в поздние эндосомы для последующей деградации в лизосомах. В настоящее время изучение начальных этапов эндоцитоза привлекает пристальное внимание, поскольку именно активация и интернализация рецептора запускают пролиферативные и антиапоптозные программы клеток. Эти исследования являются особенно актуальными, так как гиперэкспрессия рецептора ЭФР наблюдается в клетках опухолей эпителиального происхождения. В нашей работе для изучения динамики интернализации рецептора ЭФР применялись методы флуоресцентной конфокальной микроскопии. Работа проводилась на клетках с разным уровнем гиперэкспрессии рецептора ЭФР – HeLa (+) и A431 (++). Мы использовали традиционный метод визуализации рецептора ЭФР с помощью антител, а также метод выявления рецептора с применением флуоресцентно меченного ЭФР. Для этого в первом случае эндоцитоз стимулировали добавлением ЭФР с последующей фиксацией клеток и окраской антителами на рецептор; во втором случае эндоцитоз стимулировали добавлением ЭФР, меченного флуоресцентной меткой (путем присоединения биотинилированного ЭФР к конъюгированной со стрептавидином метке). В качестве флуоресцентной метки были выбраны полупроводниковые нанокристаллы – квантовые точки (КТ) и цианиновый флуорофор Cy3. С помощью этих методов были проанализированы ключевые моменты начальных этапов эндоцитоза: связывание с рецепторами на мембране, формирование окаймленных ямок, их отшнуровывание от мембраны, образование и гомотипические слияния ранних эндосом. Оказалось, что эффективность интернализации зависит от концентраций используемых лигандов. Было показано, что клетки с разным уровнем гиперэкспрессии рецептора ЭФР отличаются по характеру образования ранних эндосом. Следует подчеркнуть, что выявление рецептора или лиганда при отслеживании динамики эндоцитоза позволяет оценить различные стороны этого процесса.