ИСТИНА

Введение Применение антибиотиков создает селективное давление на микроорганизмы и приводит к появлению устойчивых (антибиотикорезистентных) форм. Ситуация с антибиотикорезистентностью патогенных микроорганизмов постоянно усугубляется и по прогнозу Всемирной организации здравоохранения к 2050 году смертность от инфекций возрастет и станет примерно такой же высокой, как от онкологических и сердечно-сосудистых заболеваний [1]. Одним из способов решения проблемы антибиотикорезистентности является поиск новых эффективных антимикробных соединений. Основным источником природных антибиотиков являются микроорганизмы, выделенные из сложных многокомпонентных биоценозов, в классическом варианте – из почв [2]. Опираясь на теорию Гаузе, мы рассматриваем антибиотики как эволюционно выработанное химическое оружие в межвидовой борьбе за существование в мире микробов, и, соответственно, микроорганизмы из таких биоценозов – как потенциальных продуцентов новых антибиотиков [3]. Объектами нашего исследования были бактерии – представители сложного многокомпонентного биоценоза, а именно микробиоты кишечника колорадского жука Leptinotarsa decemlineata. Особый интерес к изучению колорадского жука в мире обусловлен тем, что он является одним из наиболее хозяйственно опасных насекомых – вредителей сельскохозяйственных культур, а именно растений семейства пасленовых. Основной ущерб наносится картофелю, листья которого являются единственным источником питания колорадского жука и его личинок, и могут быть практически полностью уничтожены [4]. Несмотря на предшествующие описания бактериальных комплексов, ассоциированных с колорадским жуком, антибиотическая активность микроорганизмов этих комплексов ранее не изучалась. Перед нами стояла задача выделить и изучить антибиотические свойства бактерий, ассоциированных с колорадским жуком и его пищей. Описание микробного разнообразия кишечника колорадских жуков не являлось специальной целью исследования, а видовая идентификация выделенных бактерий проводилась параллельно с анализом литературы по антибиотикам, образованным представителями исследуемых видов. Материалы и методы Образцы для исследований, а именно листья картофеля, живущие на них личинки третьего возраста и имаго колорадского жука собраны вручную в июле 2020 года на опытных полях Чашниковской биологической станции МГУ (Московская область). Поля не обрабатывались биопестицидами или химикатами. Выделение микроорганизмов из исследуемых образцов осуществляли путем посева гомогенатов кишечника личинок и имаго колорадских жуков, а также гомогенатов листьев картофеля. Посев проводили на агаризованную среду следующего состава (г/л): глюкоза – 0,3, пептон – 0,3, дрожжевой экстракт – 0,3, агар – 15. Образцы инкубировали при 28°С в течение 14 сут. Глубинное культивирование бактерий проводили в восьми жидких питательных средах, разработанных для продуцентов антибиотиков в Институте новых антибиотиков имени Гаузе [5]. Видовую идентификацию бактерий проводили на основании анализа последовательности гена 16S рРНК. Геномную ДНК из бактериальной биомассы выделяли с использованием набора PowerSoil DNA Kit (MO BIO, Карлсбад, Калифорния, США). ПЦР гена 16S рРНК проводили с использованием набора BioMaster HS-Taq PCR-Sp (Биолабмикс, Новосибирск, Россия) с универсальными бактериальными праймерами: 27F (AGA GTT TGA TCC TGG CTCAG) и 1492R (TAC GGY TAC CTT GTT ACG) [6]. ПЦР проводили на термоциклере 2720 (Applied Biosystems, Фостер-Сити, США) по следующей программе: 1 – 94 °С в течение 5 мин; 2) 30 циклов с температурными интервалами 94 °С в течение 1 мин, 51 °С в течение 1 мин и 72 °С в течение 2 мин; (3) 72 °С в течение 7 мин. Нуклеотидные последовательности определяли методом Сэнгера на Genetic Analyzer 3500 (Applied Biosystems, Беверли, Массачусетс, США) с использованием универсальных бактериальных праймеров: 27f, 341f (CCT ACG GGA GGC AGC AG), 785f (GGM TTA GAT ACC TGG TAG TCC), 1114f (GCA ACG AGC GCA ACC C), 519r (GTA TTA CCG CGG CTG CTG), 907r (CCG TCA ATT CCT TTG AGT TT), 1100r (GGG TTG CGC TCG TTG), 1392r (ACG GGC GGT GTG TRC) и 1492r (TAC GGY TAC CTT GTT ACG). Программа Mega 7 и эталонные последовательности гена 16S рРНК, полученные из баз данных GenBank (blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) и проекта Ribosomal Database Project (rdp.cme.msu.edu/), были использованы для сборки нуклеотидных последовательностей [7]. Для определения антибиотической активности культуральных жидкостей методом диффузии в агар использовали тест-штаммы: Bacillus subtilis ATCC 6633, B. pumilus NCTC 8241, B. mycoides 537, Staphylococcus aureus INA 00761 (метициллинрезистентный штамм, MRSA), St. aureus FDA 209P (метициллинчувствительный штамм, MSSA), Micrococcus luteus NCTC 8340, Leuconostoc mesenteroides VKPM B-4177 (устойчивый штамм к гликопептидным антибиотикам группы ванкомицина штамм Leuconostoc mesenteroides, VRLM), Mycobacterium smegmatis VKPM Ac 1339 и Myc. smegmatis 155 mc2; Escherichia coli ATCC 25922, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 (множественная лекарственная устойчивость, МЛУ); грибы Aspergillus niger INA 00760 и Saccharomyces cerevisiae RIA 259. Результаты Из кишечника имаго (11) и личинок (10) Lep. decemlineata, а также ее корма – листьев Sol. tuberosum (11) выделено 32 штамма бактерий, из которых у 18 обнаружена антимикробная активность (56%). Эти штаммы были идентифицированы до вида или рода путем анализа гена 16S рРНК с учетом совпадения морфологических характеристик штамма с описанием соответствующих таксонов. Видовая идентификация изучаемых бактерий показала, что бактериальный кишечный комплекс колорадского жука включает как известные резидентные бактерии, ассоциированные с животными (Bacillus thuringiensis, Staphylococcus argenteus, Gordonia sp.), так и транзиторные бактерии из корма, связанные с растениями (Micrococcus aloeverae, Neobacillus drentensis), Pantoea agglomerans, Pseudomonas. poae, Pseudomonas rhizosphaerae). Среди актинобактерий преобладали стрептомицеты, но были выделены и представители других родов актинобактерий («редких» родов), а именно Gordonia, Micrococcus, Micromonospora, Nocardia (таблица). Заключение В составе микробиоты кишечника Leptinotarsa decemlineata впервые описаны: Micromonospora phytophila, Neobacillus drentensis, Pseudomonas gessardii, P. poae, P. rhizosphaerae, Pantoea agglomerans, Streptomyces chartreusis, S. clavifer, S. microflavus, S. rishiriensis, S. badius и S. coelicoflaus. Виды бактерий, выделенные из кишечной микробиоты колорадских жуков, их личинок и их пищи – листьев картофеля, различаются, что может свидетельствовать о видоспецифическом составе микробиоты имаго и личинок. Штаммы, продуцирующие противомикробные соединения, были оценены как перспективные и отобраны для последующего химического исследования на основании активности, впервые описанной у соответствующих видов, в том числе в отношении метициллин-резистентного штамма Staphylococcus aureus (MRSA), ванкомицин-резистентного Leuconostoc mesenteroides, полирезистентного штамма Pseudomonas aeruginosa и Mycobacterium smegmatis – теста для поиска противотуберкулезных средств. Высокий процент бактерий, проявляющих антимикробную активность, подтверждает целесообразность поиска продуцентов антибиотиков среди представителей сложных микробных биоценозов. Литература 1. O’Neill J. The Review on Antimicrobial Resistance. Tackling Drug-Resistant Infections Globally: Final Report and Recommendations, 2016. Available at: http://amr-review.org/sites/default/files/160518_Final%20paper_with%20cover.pdf. 2. Berdy, J. (2005) Bioactive Microbial Metabolites. The Journal of Antibiotics, 58, 1-26. http://dx.doi.org/10.1038/ja.2005.1 3. Гаузе Г.Ф. Пути изыскания новых антибиотиков. Изд-во АН СССР, 1958, с. 171. 4. Hare, J.D. Ecology and management of the Colorado potato beetle. Annu. Rev. Entomol. 2003, 35(1), 81–100. doi:10.1146/annurev.en.35.010190.000501. 5. T.A. Efimenko, A.V. Yakushev, M.V. Demiankova, A.A. Glukhova, T.I. Khusnetdinova, V.S. Sadykova, O.V. Efremenkova. Antimicrobial activity of bacteria isolated from Leptinotarsa decemlineata and Solanum tuberosum. Annals of Environmental Science and Toxicology, 2022, 6(1): 097-119. DOI: https://dx.doi.org/10.17352/aest.000061. 6. Lane, D.J. 16S/23S rRNA sequencing. In Nucleic Acids Techniques in Bacterial Systematics; Stackebrandt, E., Goodfellow, M., Eds.; John Wiley & Sons: Chichester, UK, 1991; pp. 115–147. 7. Kumar, S.; Stecher, G.; Tamura, K. MEGA7: molecular evolutionary genetics analysis version 7.0 for bigger datasets. Mol. Biol. Evol. 2016, 33, 1870–1874. doi:10.1093/molbev/msw054.