ИСТИНА

Больничные инфекции в настоящее время являются серьёзной проблемой, поскольку обычно имеют повышенную устойчивость к антибиотикам. Одними из наиболее серьёзных патогенов являются бактерии рода Klebsiella. Эти бактерии вызывают пневмонию, воспаление мочеиспускательной системы, проблемы с печенью и почками. Известно, что при обработке антибиотиками эти бактерии переходят в состояние биоплёнки, в котором они очень устойчивы, поэтому актуальным является поиск способов борьбы с биоплёнками. При проведении совместного культивирования бактерий рода Lactobacillus и бактерий рода Klebsiella оказалось, что существует два штамма лактобактерий, которые препятствуют росту Klebsiella и разрушают их. Этими штаммами являются L. reuteri LR1 и L. rhamnosus F. Эти штаммы особо интересны потому, что они являются компонентами нормальной микрофлоры кишечника человека. Был проведён протеомный анализ при совместном культивировании L. reuteri и Klebsiella, и оказалось, что в ответ на клебсиеллы в лактобактериях синтезируется ряд новых белков, которые условно можно разделить на три категории: гидролазы клеточной стенки, гидролазы нуклеиновых кислот и ферменты метаболизма. Для изучения была выбрана гидролаза нуклеиновых кислот рибонуклеозидгидролаза С (RihC). RihC относится к семейству рибонуклеозидгидролаз Rih, является неспецифической гидролазой, катализирует реакцию расщепления рибонуклеозидов до азотистых оснований и рибозы. Данный фермент синтезируется в L. reuteri в больших количествах при культивировании L. reuteri + K. pneumoniae и в меньшем количестве при тройном культивировании (L. reuteri + L. rhamnosus + K. pneumoniae). Целью данной работы было получение плазмид, содержащих ген выбранного фермента из L. reuteri с различным расположением гистага (His-tag), необходимого для очистки методом металл-хелатной хроматографии, экспрессии ферментов, их очистке и изучении кинетики расщепления нуклеозидов. Для RihC была проведена экспрессия в клетках E. coli двух вариантов фермента, выяснено, что вариант с гистагом на N-конце синтезируется примерно в три раза больше, чем вариант с гистагом на С-конце. Для обеих форм были изучены кинетические свойства в реакции с разными субстратами и выяснено, что фермент с гистагом на N-конце имеет лучшие кинетические параметры из двух форм (K M для обеих форм фермента примерно одинаковы, но k cat примерно в 1,5-2 раза выше по сравнению с формой с гистагом на С-конце для всех субстратов).