ИСТИНА

В 1974 году на химическом факультете МГУ имени М.В. Ломоносова была организована новая кафедра – кафедра химической энзимологии. В процессе создания основателем кафедры чл.-корр. АН СССР, профессором И.В. Березиным был сформирован коллектив из молодых, амбициозных и талантливых ученых. Тогда же в начале 70-х годов на кафедре были начаты исследования новых ферментов. Обзоры по эволюции и достижениям в исследовании некоторых ферментов, выполненных на кафедре химической энзимологии в сотрудничестве с другими организациями, можно найти в специальных тематических номерах - 2, 4 и 5, Вестникв Московского университета. Серия 2. Химия, 2023 по совре¬мен¬ным достижениям биокатализа. Одним из таких ферментов стала NAD+-зависимая формиат¬де¬гидрогеназа из метилотрофных бактерий Pseudomonas sp.101 (PseFDH), в то время как осталь¬ной мир выбрал для получения формиатдегидрогеназы метанолутилизирующие дрожжи. Выбор ученых МГУ источника фермента оказался настолько удачливым, что PseFDH даже по прошествии 50 лет превосходит все описанные на настоящий момент FDH по каталитических параметрам, термостабильности и устойчивости к органически раство¬рит¬елям. Отметим некоторые самые важные направления исследования и применения PseFDH. PseFDH является членом очень большого суперспмейства D-специфичных дегидрогеназ 2-оксикислот. В силу простоты катализируемой реакции – это модельный фермент для иссле¬дования основных закономерностей механизма действия ферментов этого супер¬семейства. Для выяснения взаимосвязи структура-функция были клонированы гены FDH из разных источников и в сотрудничестве с лабораторией В.О.Попова методом РСА опреде¬лены их трехмерные структуры. Кристаллы некоторых FDH были получены в космосе. Реакция, катализирумая FDH, является практически необратимой, фермент абсолютно специфичен к формиату, имеет постоянные значения kcat и KM в диапазоне рН 5.5-10.0/ Дешевизна формиата, отсутствие ингибирования им большинства ферментов (есть только одно исключение) и простота удаления из системы продукта реакции СО2 привели к тому, что с 1981 г. FDH стала одним из основных ферментов для регенерации NADH в процессах тонкого органического (в первую очередь хирального) синтеза с помощью оксидоредуктаз. Например, процесс получения L-трет-лейцина с участием FDH, реализованный фирмой Degussa в середине 90-х годов прошлого века, до сих пор остается самым крупнотоннажным процессом хирального синтеза с участием смеси индивидуальных ферментов. Получение в нашей лаборатории в 1993 г. мутантной NADP+-специфичной PseFDH инициировало очень большое количество работ по хиральному синтезу с регенерацией NADPH. Имеющиеся в настоящее время у зарубежных коллег препараты NADP+-FDH по своим свойствам соответствуют вариантам NADP+-PseFDH, полученным в нашей лаборатории еще 20 лет назад, в то время как в нашей лаборатории получены улучшенные мутанты второго и тертьеого поколений. PseFDH была первой бактериальной FDH, ген которой был клонирован и экспрессирован в клетках E.coli. Нами был получены штаммы-суперпродуценты разных вариантов рекомбинантной PseFD и разработан процесс ихо культивирования в ферментере объемом до 400 л. Одно культивирование позволило получить более 11 миллионов ед. активности, что соответствует 5-летней потребности фирмы Degussa. Процедура очистки позволяет получить препараты 80% чистоты и выходом по активности 90% без использования хроматограии. Методом рационального дизайна получены мутантные варианты с повышенной температурной и химической стабильностью. Препараты фермента могут храниться более 15 лет при +4 оС без потери активности. В растениях FDH локализована в митохондриях и при стрессовых воздействиях ее соедражние достигает 10% всех митохондриальных белков.Низколе содеражние фермента не позволяло проводить его систематические исследования. Нами впервые в мире были получены в E,coli рекомбинантные растительные FDH из Arabidopsis thaliana и сои Glycine max. Были получены мутантные формы с повышенной каталитической активностью (до 2х ра) и термостабильностью. Поскольку NADHб синтезируемый FDH в митохондриях необходим для ликвидации последствий стресса, замена природных генов FDH на мутантые порзволит повысить эффективность синтеза NADH в два раза без дополнительной нагрузки клетки на синтез самих ферментов, т.е. такой подход позволит получить растения с повышенной стрессоустойчивостью. Гены АВР были найдены практических по всех патоенах и в них FDH также является белком стресса. При переходе Staphylococcus aureus из состояния планктона в биопленки уровень биосинтеза FDH возрастает в 20 ра, а уровень мРНК фермента занимает 3е место. SauFDH имеет гомологию с другими FDH не более 40% и фермент представляет отдельную ветвь эволюции FDH. Ген SauFDH был нами клонирован и экспрессирован в E.coli. Оказалось, что удельная активность SauFDH в два раза выше остальных FDH, а по термостабильности уступает только PseFDH. В настоящее время совместно с В.И.Польшаковым проводятся эксперименты по определению структуры SauFDH с помощью ЯМР и поиск ингибиторов, которые являются потенцальными препаратами против биопленок стафилококков. NAD+/NADH является важнейшим коферментом, который используют более тысячи дегидрогеназ. Соотношение концентраций NAD+/NADH в норме и патологии значимо отличается и может быть использован для диагностики различных заболеваний. Нами был разработан селективный метод определения NAD+ на фоне NADH, NADP+и NADPH. Было показано значительное изенение концентраций кофермента при нейро- и кардио- заболеваниях. В данном методебыла использована FDH, клонированная нами из термотолерантных дрожжей Oataea parapolymorpha DL-1 (OpaFDH). Оказалось, что OpaFDH имеет самую высокую термостабильность среди эукариотиченских FDH. Одним изз современных направлений по jgdsityb. Эффективности биокатализаторов яв¬ля¬ется получение гибридных катализаторов, в которых два (и более) фермента, катали¬зи¬ру¬ю¬щих сопряженные реакции, объединены в одну полипептидную цепь. Нами были получены раз¬личные химерные каталихаторы мутантной NAD+- специфичной PseFDH с моно¬ок¬си¬ге¬на¬зой CYP102A1 ВМ3 (Р450) и фенилацетонмонооксигеназы из Thermobifida fusca. Гибридные ферменты продемонстрировали эффективность, которая превышала таковую для простой смеси ферментов до 70 раз. Химера PseFD-P450 имела последовательность более, чем из 1600 ак остатков и является самым большим слитым ферментом в мире. PseFDH проявляет уникальную стабильность против инактивации протеазами и органи¬ческими растворителями. Фермент не инактивировался даже на разделе фаз вода-гептан. Исследование свойств различных FDH в ионных жидкостях показало перспек¬тивносить применения таких растворителей для конверсии плохо растворимы в воде соединений. В последние 10 лет наблюдается бум в исследованиях по биокаталитической фиксации СО2 из атмосферы. Одним из ферментов, который активно используется, является FDH. Рассмотрены перспективы работ в данном направлении. Работа выполнена в рамках государственного задания, а также грантов РФФИ, РНФ, Фонда Александра фон Гумбольдта, INTAS, Госконтрактов Минобрнауки и др. и