ИСТИНА

В условиях гипоксии (инсульт, инфаркт и т.д.) клетки вырабатывают специальный фактор HIF, который запускает синтез более 100 генов для ликвидации последствий гипоксии. Утилизация HIF в клетке происходит в результате сложного многостадийного процесса, запускаемого за счет гидроксилирования остатка Pro564 субъединицы альфа-HIF с помощью специального фермента HIF пролилгидроксилазы (HIFPH, 3 изофермента). Введение ингибиторов HIFPH позволяет снизить скорость деградации фактора и, таким образом, повысить его общую активность. В настоящее время ведущие мировые фармацевтические и биотехнологиские корпорации (FibroGen, Procter&Gamble, Johnson&Johnson, Amgen, Merck, Glaxo Smith Kline и др.) проводят поиск ингибиторов HIFPH. Некоторые из найденных ингибиторов из них находятся на различных стадиях клинических испытаний. Нами с использованием репортерной линии клеток (HIF1ODD (HIF1 Oxygen Degradable Domain)-luciferase reporter assay)) был проведен скриниг библиотеки разветвленных оксихинолинов и были найдены два соединения (Соединения 7 и 8), в присутствии которых активность HIF возрастала, причем эффективные концентрации этих соединений были в 15 и 40 раз ниже, чем у подобных ингибиторов, созданных фирмами FibroGen FG-4592 и Amgen IOX2 [1]. Для подтверждения того, что мишенью Соединений 7 и 8 является именно HIFPH последовательности каталитических доменов 3-х изоферментов HIFPH были клонированы и экспрессированы в клетках E.coli [2]. Все три формы каталитических доменов HIFPH экспрессировались в основном в виде телец включения. Для изофермента 2 (HIFPH2) была разработана высокоэффективная методика реактивации и по своей удельной активности реактивированная из телец включения HIFPH2 (rHIFPH2) превосходила растворимую форму (sHIFPH2) в 4,8 раза. На гомогенных препаратах rHIFPH2 было показано, что оба соединения являются ингибиторами фермента. В результате последующего анализа аналогов Соединения 7 был найден вариант с активностью в 3 раза выше, чем у Соединения 7 (соединение 7х) [3]. Для анализа цитотоксичности и путей метаболизма Соединений 7, 7х и 8 в клетках печени был использован специальный проточный реактор с кассетами из сфероидов клеток HepaRG, получивший название "печень-на-чипе" (“liver-on-a-chip”) [4]. Соединения 7 и 7х не проявляли цитотоксичности вплоть до концентраций 200 M (на два порядка выше области концентраций биологической активности, предел растворимости ). В случае Соединения 8 цитотоксичность не наблюдалась вплоть до концентрации 100 M. Для исследования путей метаболизма Соединений 7 и 8 была разработана специальная панель субстрат-ингибитор для четырех основных цитохромов С человека. Разработанная панель была проверена на двух модельных соединениях - варфарине и дазатинибе. После валидации панели было показано, что оба Соединения 7 и 8 гидроксилируются цитохромами CYP3A4 and CYP2B6. Наиболее интересным результатом является факт активации этими Соединениями цитохрома CYP2B6. В настоящее время ведется разработка расширенной панели из 6 цитохромов. Работа поддержана Российским научным фондом, грант 16-14-10226.