ИСТИНА

Пенициллинацилаза (ПА; КФ 3.5.1.11) относится к суперсемейству Ntn-гидролаз (с N-концевым нуклеофилом) и применяется в фармацевтической промышленности при получении полусинтетических β-лактамных антибиотиков и для синтеза оптически активных β-аминокислот, что имеет важное значение для медицины. Промышленное применение ферментов требует, чтобы биокатализатор характеризовался высокой температурной, pH- и операционной стабильностью, а также высокой стабильностью к органическим растворителям и улучшенными каталитическими параметрами для конкретного процесса. Стоимость биокатализатора также играет немаловажную роль и зависит от генетической конструкции и условий культивирования штамма – продуцента рекомбинантного фермента. Объектом исследования данной работы является пенициллинацилаза G (ПА) из бактерии Alcaligenes faecalis (AfПА), которая обладает рядом преимуществ по сравнению с общепринятым ферментом ПА из Escherichia coli, в том числе у AfПА более широкий pH-оптимум активности, высокая активность при щелочных значениях pH 10-11 и более высокая температурная стабильность. Ген, кодирующий гетеродимерную AfПА, исходно состоит из одной полипептидной цепи (предшественника) и включает помимо α- и β-субъединицы сигнальный пептид и спейсер, соединяющий в предшественнике субъединицы. Одна из основных трудностей при получении ПА заключается в сложной посттрансляционной модификации (процессинге) белка-предшественника из одной полипептидной цепи с образованием активного гетеродимера, что оказывает влияние на выход активного фермента и зависит от наличия нуклеотидных замен при получении мутантных форм. Разработка другой генетической конструкции, исключающей процессинг фермента, позволило бы упростить процедуру его получения на стадии культивирования, а именно сократить продолжительность и сделать одинаковыми условия культивирования для мутантных форм. В нашей лаборатории был клонирован новый ген ПА из Alcaligenes faecalis, содержащий уникальные аминокислотные замены по сравнению с другими тремя известными AfПА. Создана система экспрессии в E.coli и разработана методика очистки для ПА дикого типа. В данной работе методом ПЦР была получена новая генно-инженерная конструкция, которая кодирует одноцепочечную (пермутированную) ПА без сигнального пептида и спейсера, причем β-субъединица предшествует α-субъединице. Инженерия четвертичной структуры включала компьютерное моделирование одноцепочечной ПА на основе модельной структуры фермента дикого типа, в том числе моделирование аминокислотного состава и размера линкера, связывающего C-конец β-субъединицы и N-конец α-субъединицы. Проведена оптимизация экспрессии рекомбинантного штамма E.coli и очистка пермутированной ПА из A.faecalis. Изучены каталитические параметры полученного фермента и температурная стабильность в широком диапазоне температур и концентрации буфера при разных pH. Проведена сравнительная характеристика свойств ПА дикого типа и одноцепочечной ПА. Работа выполнена при поддержке Российского научного фонда (грант 16-14-00043).