ИСТИНА

Митохондриальная изоформа неорганической пирофосфатазы (РРА2) у дрожжей и человека играет важную роль в аэробном метаболизме [1]. Структура митохондриальных пирофосфатаз пока не решена экспериментально. Настоящая работа направлена на решение актуальной биохимической задачи: выяснения структурных особенностей фермента для понимания принципов его функционирования и регуляции. Основным объектом данной работы является митохондриальная пирофосфатаза дрожжей Ogataea parapolymorpha (ОрРРА2), имеющая высокую схожесть с ферментом человека. Биохимические и структурные исследования показывают, что динамическое поведение ОрРРА2 может играть важную роль в регуляции ее активности. Гомологичным моделированием была получена пространственная структура этого фермента и проведена симуляция молекулярной динамики. Согласно ее результатам, субъединицы димера в растворе принимают различные конформации. Установлено, что диссоциация димера ОрРРА2 на мономеры сопровождается значительным снижением каталитической активности. Симуляция молекулярной динамики мономера и димера ОрРРА2 позволила предположить путь передачи информации из межсубъединичного интерфейса в активный центр. Также структурный анализ позволил найти возможные сайты связывания недавно обнаруженных аллостерических активаторов фермента, NADH и АТP, в молекуле фермента. Однако выдвинутые предположения нуждаются в экспериментальном подтверждении. С этой целью предполагается использовать ЯМР спектроскопию. Этот метод позволит решить структуру фермента, охарактеризовать его динамические свойства, а также экспериментально определить сайты связывания найденных эффекторов. Получение белка, который можно исследовать с помощью ЯМР, состоит из нескольких стадий изотопного мечения. К настоящему моменту мы получили генно-инженерную культуру клеток E. coli, адаптированную к росту в D2O и экспрессирующую ОрРРА2, а также образец белка, меченный 15N и частично меченный дейтерием. Таким образом, результаты расчетной и биохимической части нашей работы позволили выдвинуть предположения о возможных путях регуляции активности Op-PPA2 и структурных особенностях ее работы. Эти предположения планируется проверить с помощью метода ЯМР.