ИСТИНА

Оксидазы D-аминокислот (DAAO) катализируют превращение D-аминокислот в соответствующие α-кето- кислоты с образованием пероксида водорода и иона аммония. В основном выделяют два вида оксидаз D-амино- кислот – это оксидазы с широким спектром субстратной специфичности и высокоспецифичные к D-аспартату. Фермент выполняет важные физиологические функции в организме млекопитающих и находит широкое применение в биотехнологии. Наиболее важным применением DAAO является процесс получения 7-амино- цефалспорановой кислоты (7-АЦК) из цефалоспорина C. 7-АЦК затем используется для синтеза цефалоспори- новых антибиотиков различных поколений. Сейчас все большее внимание уделяется DAAO для использования в качестве биосенсоров на D-аминокислоты. Уровень D-аминокислот является маркером развития различных заболеваний. Кроме того, уровень D-аминокислот является показателем степени ферментации и бактериального заражения продуктов питания. Функции и роль DAAO в дрожжах до сих пор не изучены. При исследовании оксидаз D-аминокислот в геномах микроорганизмов находили не более 2-х генов DAAO. Нами при анализе генома дрожжей Ogataea parapolymorpha DL-1 было обнаружено 6 генов, потенциально кодирующих DAAO. Эти гены были клонирова- ны и экспрессированы в клетках E. coli - 5 в активной и растворимой форме и 1 как активные тельца включе- ния. Растворимые ферменты были очищены и проведена их биохимическая характеризация. Изучено влияние температуры и pH на активности и стабильности ферментов, определены каталитические параметры с набором D-аминокислот, построены трехмерные модельные структуры и проведен их детальный анализ. Было показано, что новые DAAO отличаются по олигомерному составу и большинство из них имеет уникальные спектры суб- стратной специфичности, а также рН-профили активности и стабильности. Гены DAAO характеризуются очень низкой гомологией, и их корректная аннотация в геномах является боль- шой проблемой и часто выполняет неправильно. Нами на основе созданной базы «свойства-структура» был раз- работан биоинформационно-структурный подход для идентификации генов новых DAAO. Используя данный подход, можно с высокой вероятностью отличить кандидатные гены новых оксидаз D-аминокислот от генов других близкородственных ферментов (например, глициноксидазы), а также предсказать субстратную специ- фичность этих ферментов. Эффективность предложенного подхода была подтверждена на примере геномов экстремофильных бактерий и позволила впервые в мире найти ген DAAO в археях.