ИСТИНА

Мотивация и цель: Секвенирование нового поколения (NGS-Next Generation Sequencing) позволило провести множество важных исследований в области молекулярной онкологии. Важно отметить, что методы NGS все еще находятся в стадии разработки и имеют свои ограничения. Секвенаторы с высоким качеством прочтений не могут производить прочтения достаточной длины, а секвенаторы с длинными прочтениями не могут обеспечить прочтения высокой точности с приемлемым выходом. Нанопоровое секвенирование конкатемерных библиотек с получением консенсуса мономерных последовательностей позволяет получать достаточно длинные считывания с более высокой точностью [1, 2]. Мы предлагаем новый метод получения конкатемерных библиотек ампликонов без использования праймеров на этапе получения конкатемеров путем амплификации по типу катящегося кольца (RCA-Rolling Circle Amplification), для уменьшения доли химерных молекул. Мы провели предварительное тестирование разработанного протокола. Методы и алгоритмы: С помощью набора Native Barcoding Kit 24 V14 были получены шесть баркодированных библиотек, соответствующих вариабельным областям альфа-цепи Т-клеточного рецептора (TCRA - T-cell receptor alpha chain) и бэта-цепи Т-клеточного рецептора (TCRB - T-cell receptor alpha chain) из трех образцов РНК опухолей колоректального рака. Каждый мономер в конкатемерной молекуле нес уникальный молекулярный индекс (УМИ) длиной 17 п.о. для обнаружения и фильтрации химерных прочтений. Секвенирование проводили на проточной ячейке R10.4. Полученные данные анализировали с помощью пакетов Bowtie2, MAFFT, MiXCR и собственных скриптов, написанных на bash, питоне 3 и R. Результаты: Для библиотек вариабельных участков TCRA было получено 3954-6668 прочтений, TCRB - 4013-6427. Медианное количество мономеров для всех библиотек составило 7; 25% прочтений содержали более 13-14 мономерных единиц, а 10% - более 22-24. Консенсусные последовательности были получены для каждого конкатемера и проанализированы с помощью программы MiXCR. Мы идентифицировали 33-69 и 29-176 клонов TCRA и TCRB, соответственно. Клонов, которым соответствовали, как минимум, 3 прочтения, было 3-21 (TCRA) и 4-14 (TCRB). Количество считываний для наиболее представленных клонов составило 31 (TCRA) и 22 (TCRB). Выводы: Применение метода RCA без использования праймеров с последующим нанопоровым секвенированием позволило успешно реконструировать вариабельные области TCRA и TCRB полной длины на основе нуклеотидных последовательностей мономеров, несущих УМИ. Первичные данные свидетельствуют о том, что это перспективный подход к полноразмерному секвенированию и высокопроизводительному профилированию гетерогенных РНК с высоким уровнем сходства, к примеру, РНК TCR, BCR и ретроэлементов в опухолевых образцах.