ИСТИНА

Для исследования структуры и диагностики образования амилоидных фибрилл, накопление которых сопутствует многим тяжелым заболеваниям (болезнь Альцгеймера, Паркинсона и др.), эффективно используются флуоресцентные зонды, в частности, бензатиозольный краситель тиофлавин Т (ThT). Это обусловлено специфичностью его взаимодействия с амилоидными фибриллами и существенным возрастанием квантового выхода флуоресценции красителя, инкорпорированного в фибриллы. Современные представления о механизмах взаимодействия ThT с фибриллами сложились на основе исследований in vitro в разбавленных буферных растворах, что существенно отличается от условий густонаселенной среды клетки (условий макромолекулярного краудинга). Такие условия могут влиять на способность белков образовывать амилоидные фибриллы и их взаимодействие с потенциальными диагностическими агентами, а также на свойства самих флуоресцентных маркеров. Целью данной работы стало исследование фотофизических свойств специфического флуоресцентного зонда ThT в условиях макромолекулярного краудинга. Для создания условий, имитирующих условия внутриклеточной среды, in vitro используются краудинг-агенты – инертные полимерные молекулы с большим молекулярным весом. Показано, что поглощение используемых в данной работе краудинг-агентов (декстана, PEG12000 и PEG400) в области поглощения ThT отсутствует, а интенсивность их собственной флуоресценции не вносит значительного вклада в флуоресценцию красителя. Оказалось, что присутствие в растворе краудинг-агентов или глицерина (MW=72 Да), используемого в качестве низкомолекулярного агента для создания условий микровязкости, приводит к длинноволновому сдвигу спектров поглощения и флуоресценции ThT, а также к возрастанию его коэффициента молярной экстинкции, квантового выхода флуоресценции и времени жизни флуоресценции. При этом показано, что фотофизические характеристики ThT в присутствии краудинг-агентов изменяются в значительно меньшей степени, чем в присутствии амилоидных фибрилл инсулина и лизоцима, что подтверждает возможность использования ThT в качестве диагностического агента в условиях молекулярного краудинга.