ИСТИНА |
Войти в систему Регистрация |
|
ИСТИНА ИНХС РАН |
||
Ацетилхолинэстераза (AChE) играет ключевую роль в холинергической синаптической передаче, а нарушение ее активности может привести к ряду тяжелых заболеваний. Флуоресцентный зонд тиофлавин Т (ThT), который является специфическим маркером возникновения амилоидных фибрилл, эффективно используется для исследования структуры, активности и особенностей функционирования AChE. Однако на данный момент нет единого мнения о стехиометрии комплекса ThT-AChE, и, в частности, о возможности образования красителем эксимеров в связанном с ферментом состоянии. Впервые для определения параметров связывания ThT с AChE и характеристик связанного с ферментом красителя был использован подход, основанный на подготовке исследуемых растворов методом равновесного микродиализа, который ранее был предложен нами для изучения взаимодействия ThT с амилоидными фибриллами [2]. С использованием абсорбционной спектроскопии этих растворов была рассчитана стехиометрия связывания ThT с AChE (1:1). Кроме того впервые определен спектр поглощения ThT, связанного с AChE, который, как оказалось, сдвинут в длинноволновую область по сравнению со спектром поглощения свободного красителя в водном растворе. Более длинноволновое положения спектра поглощения ThT связанного с AChE может быть обусловлено большей гидрофобностью микроокружения этих молекул красителя. С использованием метода молекулярного моделирования показано, что угол между бензтиазольным и аминобензольным кольцами ThT, связанного с периферическим сайтом AChE (~39.7°), практически совпадает с углом между этими фрагментами для свободного красителя в водном растворе (~37°). Флуориметрическое исследование растворов, полученных методом равновесного микродиализа, позволило показать, что положение спектров флуоресценции свободного и связанного с AChE красителя совпадают, а возрастание квантового выхода флуоресценции ThT при взаимодействии с ферментом может быть объяснено молекулярно-роторной природой ThT. Полученные результаты в совокупности с информацией о стехиометрии связывания ThT с AChE свидетельствуют о необоснованности гипотез об образовании связанным красителем эксимеров. Сравнение аффинности взаимодействия ThT с AChE и с амилоидными фибриллами (для которых ранее уже была доказана мономерная модель связывания красителя), а также анализ фотофизических свойств связанного ThT, позволили сделать заключение о сходном механизме этих взаимодействий, а также предположить ключевую роль во взаимодействии ThT с AChE ароматических остатков, что характерно для взаимодействия ThT с некоторыми амилоидными фибриллами.