ИСТИНА

Амилоидные фибриллы – особое компактное состояние белка, которому отвечает глубокий минимум свободной энергии, обусловленный межмолекулярными взаимодействиями макромолекул белка. Исследования последних лет показали, что подобные структуры при определенных условиях могут образовывать практически все белки. Несмотря на большое разнообразие амилоидогенных белков, различающихся по массе и структуре, архитектура всех амилоидных и амилоидо-подобных фибрилл является сходной – они представляют собой пучки высокоупорядоченных обогащенных -складчатыми структурами протеиновых нитей и могут достигать нескольких микрометров в длину и десятков нанометров в диаметре. Долгое время считалось, что амилоидные фибриллы, полученные на основе разных белков, полностью идентичны. Однако за последние годы структуры нескольких амилоидо-подобных фибрилл были расшифрованы с высоким разрешением, и было показано их различие. Поскольку фибриллярное состояние белков, является одним из основных термодинамически стабильных состояний белковой молекулы, изучение и сравнение их структуры в настоящее время является весьма актуальной задачей. Исследования последних лет показали, что флуоресцентный краситель тиофлавин Т (ThT), который ранее использовался для диагностики возникновения амилоидных бляшек при ряде тяжелых заболеваний, таких как болезни Альцгеймера и Паркинсона, диабет второго рода, прионные заболевания, и т.д., может быть инструментом для изучения структуры амилоидных фибрилл. Для этого в первую очередь необходимо охарактеризовать взаимодействие ThT с амилоидными фибриллами, определив параметры их связывания. Нами было показано, что флуоресцентный метод, применявшийся для этого ранее, в принципе не подходит для этих целей. Для изучения взаимодействия ThT с амилоидными фибриллами мы предлагаем использовать метод абсорбционной спектрофотометрии растворов, полученных методом равновесного микродиализа. Нами была разработана методика и составлены протоколы для определения числа мод связывания ThT с амилоидными фибриллами, констант связывания и числа мест связывания для каждой из мод, а также спектров поглощения и коэффициентов молярной экстинкции красителя, связанного с каждой из мод. Применимость предложенной методики продемонстрирована на амилоидных фибриллах, полученных на основе амилоидогенных белков инсулина, лизоцима и -микроглобулина. Полученные результаты подтверждают предположения о том, что фибриллы, полученные на основе разных белков, различны, а предлагаемый нами подход может использоваться для сравнительного изучения их структуры.