ИСТИНА

Молекулярная диагностика инфекций является частным случаем поиска целевой нуклеотидной последовательности и/или целевого антигена. В общем случае молекулярная диагностика не зависит от природы патогена (меняется только метод подготовки образца к анализу) и основана на двух принципах высоко специфического молекулярного узнавания, а именно: на молекулярной гибридизации комплементарных нуклеиновых кислот и взаимодействии антитела с антигеном. В лаборатории нуклеиново-белковых взаимодействий отдела биохимии вирусов МГУ им. М.В.Ломоносова были освоены, адаптированы и модифицированы наиболее распространенные технологии молекулярной диагностики инфекций вирусными и бактериальными патогенами как в лабораторных, так и внелабораторных условиях. Для подготовки образцов к диагностическому анализу был разработан метод выделения РНК из бактерий, клеток животных и растений с помощью мощного, водорастворимого и нетоксичного хаотропного агента – трихлорацетата аммония. Препараты вирусных и клеточных РНК были пригодны для селективной гибридизации, имели электрофоретическую подвижность и УФ-спектры, идентичные РНК, выделенным фенольным методом. Известно, что РНК многих вирусов из разных семейств ковалентно, фосфодиэфирной связью своего 5’-концевого нуклеотида, связаны с белком ВПг. Для пикорна-, калици- и потивирусов ковалентная связь образована остатками 5’-концевой уридиловой кислоты и тирозина белка ВПг. Была синтезирована модель, имитирующая «узловую» структуру концевого фосфодиэфира, и на этот гаптен получены поликлональные антитела. С помощью этих антител иммунохимически с помощью флуресцентной микроскопии можно следить за развитием пикорнавирусной инфекции в зараженных клетках. Не вызывает сомнения их пригодность для обнаружения калици- и потивирусных соединений РНК-ВПг in vitro и in vivo. При создании ДНК-зондов для детекции вирусной инфекции клеток асцитной карциномы Кребс II пикорнавирусами, а также вирусных и вироидной инфекций картофеля, с успехом использовалось мечение ДНК-зондов гаптеном – хлордиэтилентриамино платиной хлористой (диен-платиной). Достоинство мечения двояко: с одной стороны, производное платины связывается с рекомбинантной ДНК количественно в мягких условиях и практически не влияет на температуру плавления дуплексов кДНК-РНК патогена, с другой – определение связавшегося ДНК-зонда с мишенью производится иммуноферментным анализом с флуоресцентным субстратом, что позволяет определять субпикограммовые количества патогенной РНК. Предельная чувствительность определения патогенов, когда в анализируемой пробе гарантированно определяется одна молекула вирусной или вироидной РНК, была получена комбинированной технологией ОТ-ПЦР и определением продукта амплификации – специфическим ДНК-зондом, который, в свою очередь, определялся иммуноферментным анализом с хемилюминисценым субстратом на нитратцеллюлозной мембране. Для диагностики нескольких патогенов были разработаны макрочипы низкой плотности для одновременного определения шести вирусов и вироида картофеля на нитратцеллюлозной мембране. Оптимизацию ДНК макрочипа проводили по длине детектируемого полинуклеотида и по количеству рекомбинантной ДНК, нанесенной на чип. Суммарную РНК из зараженных и незараженных тканей при этом метили гаптеном – диен-платиной, гибрид которой с рекомбинантной ДНК на чипе определяли с помощью иммуноферментного анализа. Полученные макрочипы можно было использовать повторно. Для массовой практической экспресс-диагностики, особенно важной в случае пандемий, эпизоотий и эпифитотий, были разработаны иммунохроматографические тест-системы (тест-полоски). В этом анализе определение вирусной и бактериальной инфекции проводится визуально, их применение доступно обывателю даже в поле, время анализа составляет 10-15 мин. В рамках гос.контракта ЕврАзЭс с помощью более чем 2000 тест-полос был проведен диагностический анализ центральной коллекции семян картофеля РФ и коллекции сортообразцов НПЦ НАН Белоруссии по картофелеводству и овощеводству на зараженность 5 вирусами и бактериями, вызывающими водянистую гниль стеблей и черную ножку. Чувствительность иммунохроматографического анализа, в котором используются конъюгаты антител с коллоидным золотом, лишь немного уступает ИФА. Усилением сигнала солями серебра чувствительность может быть увеличена на порядок. Для труднодоступного, флоэмно ограниченного вируса, накапливающегося в растении в незначительном количестве, что препятствует получению к нему чистых антител, был создан генноинженерный конструкт, представляющий собой химеру, состоящую из РНК высоко накапливающегося вируса и белка оболочки труднодоступного вируса. Было установлено, что химерный вирус в агроинокулированном растении имеет икосаэдрическую форму, идентичную дикому изоляту, что важно для специфичной иммуногенности, причем выход вируса и вирусного антигена увеличился на три порядка. Полученные к химере антитела узнавали природный изолят вируса, что позволило создать целевой иммунохроматографический диагностикум для массовой диагностики.