ИСТИНА

IRES-элементы (internal ribosome entry site) – это участки вирусных РНК, способные привлекать рибосомы на внутренние области транскриптов и обеспечивать их кэп-независимую трансляцию [1]. IRES-элементы некоторых пикорнавирусов для эффективной работы, помимо классических трансляционных факторов, нуждаются в дополнительных клеточных белках – ITAF (IRES trans-acting factors). Ранее в трансляционной системе, реконструированной из очищенных компонентов, показано, что IRES-элемент вируса ящура (FMDV, foot-and-mouth disease virus) для образования 48S преинициаторного комплекса нуждается в клеточном белке ITAF45/PA2G4 [2,3]. В то же время на IRES-элементе родственного вируса энцефаломиокардита (EMCV) 48S комплекс собирается и в отсутствие PA2G4 [3]. Однако проведенный нами полногеномный нокаутный CRISPR-скрининг выявил в некоторых клетках, переживших заражение вирусом EMCV, нокаут гена PA2G4. Мы задались целью определить важность белка PA2G4 для жизненного цикла EMCV в клетках человека и его вклад в трансляцию, направляемую IRES-элементом EMCV. В культуре зараженных EMCV клеток HEK293T, нокаутных по гену PA2G4 (PA2G4-KO), мы не наблюдали цитопатического действия вируса, тогда как клетки дикого типа (WT) погибали спустя восемь часов после заражения. Также титр вируса в культуральной среде, полученной от клеток WT через сутки после заражения, был значительно выше титра вируса, полученного в результате заражения клеток PA2G4-KO. На основе клеток PA2G4-KO мы создали две моноклональные линии, селективно экспрессирующие каждую из двух изоформ PA2G4, представленных в клетках человека: p42 (PA2G4-KO+p42) и p48 (PA2G4-KO+p48). При заражении вирусом EMCV клеток PA2G4-KO+p42 цитопатического действия вируса мы не наблюдали. Напротив, заражение клеток PA2G4-KO+p48 вызывало столь же яркие цитопатические эффекты, как при заражении клеток WT. Также методом титрования активных вирусных частиц в культуральной среде мы установили, что EMCV не размножается в клетках, избирательно продуцирующих изоформу р42, в то время как заражение клеток PA2G4-KO+p48 приводит к эффективному размножению вируса. Далее методом in vitro трансляции мы показали, что репортерные мРНК с IRES-элементом FMDV значительно хуже транслируются в бесклеточной системе на основе клеток PA2G4-KO, чем в системе из клеток WT, что согласуется с ранними данными по анализу сборки 48S комплексов из очищенных компонентов. Добавление в систему рекомбинантного белка p48, но не p42 восстанавливало активность. Однако также выяснилось, что мРНК c IRES-элементом EMCV одинаково хорошо транслируется в лизатах клеток PA2G4-KO и дикого типа, что расходится с наблюдениями в опытах по мРНК-трансфекции живых клеток. Полученные результаты свидетельствуют о том, что хотя в живых клетках белок PA2G4 действительно необходим для размножения EMCV, в системах in vitro его отсутствие не влияет на эффективность работы IRES-элемента EMCV. Причину этих различий еще предстоит выяснить. Обсуждаются также перспективы структурного исследования комплекса PA2G4 с IRES-элементом вируса. Исследование поддержано грантом РНФ № 23-14-00218. Литература 1. Sorokin I.I., Vassilenko K.S., Terenin I.M., Kalinina N.O., Agol V.I., Dmitriev S.E. Non-canonical translation initiation mechanisms employed by eukaryotic viral mRNAs // Biochemistry (Mosc), 2021, 86(9), 1060-1094. 2. Pilipenko E.V., Pestova T.V., Kolupaeva V.G., Khitrina E.V., Poperechnaya A.N., Agol V.I., Hellen C.U.Т. A cell cycle-dependent protein serves as a template-specific translation initiation factor // Genes Dev., 2000, 14(16), 2028-2045. 3. Yu Y., Abaeva I.S., Marintchev A., Pestova T.V., Hellen C.U.Т. Common conformational changes induced in type 2 picornavirus IRESs by cognate trans-acting factors // Nucleic Acids Res., 2011, 39(11), 4851-4865.