ИСТИНА

Использование мРНК считается многообещающим подходом для доставки генов в организм пациента из-за минимальной опасности модификации генома и отсутствия зависимости от пролиферативного статуса клеток. Синтетические мРНК, полученные с помощью in vitro транскрипции, могут успешно применяться для вакцинации, заместительной терапии или репрограммирования клеток [1]. Однако такие транскрипты зачастую активируют ответ врождённого иммунитета, что усложняет мРНК-трансфекцию первичных клеток и использование мРНК-технологий в живых организмах [2]. Включение модифицированных нуклеотидов в транскрипт может снизить иммунный ответ, увеличить стабильность мРНК и таким образом повысить продолжительность экспрессии и общий выход белкового продукта. Однако опубликованные данные о влиянии нуклеотидных модификаций на продукцию белка противоречивы. Важную роль в мРНК-технологиях играет также использование специфических регуляторных элементов – в частности, сайтов внутренней посадки рибосомы (IRES) и кэп-независимых энхансеров (CITE), обеспечивающих эффективную трансляцию мРНК в условиях стресса [3]. Целью данной работы было исследования влияния N1-метилпсевдоуридина как наиболее широко используемого в мРНК-терапии модифицированного нуклеозида на экспрессию репортерных мРНК, различающихся механизмами инициации трансляции, в нескольких системах in vitro и in vivo. Сравнивали эффективность и кинетику накопления люциферазы в случае обычных и модифицированных транскриптов в бесклеточной системе трансляции, приготовленной из печени мыши, а также путем трансфекции репортерных мРНК в культивируемые линии клеток человека (HeLa, HEK293T), первичные фибробласты и дендритные клетки мыши. Эффекты модификаций сильно различались в зависимости от механизма инициации трансляции. В случае мРНК с кэп-зависимыми лидерами влияние модификаций на эффективность, а часто и на продолжительность экспрессии было положительным, хотя степень выраженности эффекта зависела от последовательности 5’-нетранслируемой области. Для модифицированных мРНК мы зафиксировали также задержку появления продукта, что указывает на снижение скорости элонгации. В то же время в случае IRES-зависимой трансляции введение N1mΨ вместо 100% U очень сильно ингибировало трансляцию, что объясняется, по-видимому, нарушением вторичной и третичной структуры РНК. Мы показали, что эти эффекты характерны для вирусных IRES-элементов всех четырёх типов (на примере IRES из РНК вирусов HRV, EMCV, CSFV, CrPV и ряда других). Интересно, что инициация трансляции, опосредованная 5’-CITE (в частности, JK-доменом EMCV), оказалась эффективной в случае модифицированных транскриптов. Замена U на N1mΨ препятствует эффективному функционированию IRES-элементов в мРНК, однако положительно сказывается на работе кэп-зависимых и CITE-зависимых лидеров. Обнаруженные закономерности важны для разработки новых эффективных вариантов терапевтических мРНК. Работа выполнена при поддержке гранта РНФ 23-14-00218. Литература 1. Chaudhary, N., Weissman, D., Whitehead, K.A., 2021. mRNA vaccines for infectious diseases: principles, delivery and clinical translation. Nat. Rev. Drug Discov. 20, 817–838. 2. Karikó, K., Ni, H., Capodici, J., Lamphier, M., Weissman, D., 2004. mRNA is an endogenous ligand for Toll-like receptor 3. J. Biol. Chem. 279, 12542–12550. 3. Sorokin, I.I., Vassilenko, K.S., Terenin, I.M., Kalinina, N.O., Agol, V.I., Dmitriev, S.E., 2021. Non-Canonical Translation Initiation Mechanisms Employed by Eukaryotic Viral mRNAs. Biochemistry (Moscow) 86, 1060–1094.