ИСТИНА

Одним из наиболее часто используемых способов наблюдения и измерения экспрессии генетических конструкций являются люциферазные системы, основанные на способности белков семейства люцифераз катализировать хемилюминесцентное окисление специфических субстратов, называемых люциферинами. По сравнению с другими репортерными системами, основанными на иных ферментах или флуоресцентных белках, использование люцифераз позволяет добиться значительно более высокого соотношения сигнал/шум и анализировать быструю динамику экспрессии. Использование двух люцифераз, различающихся спектральными характеристиками, позволяет одновременно наблюдать за двумя независимыми процессами. Наиболее часто используемой парой является сочетание люциферазы светлячка и люциферазы Renilla, требующих для своей работы два различных субстрата. Недостатком этой системы является неспособность целентеразина, субстрата люциферазы Renilla, проникать через клеточную мембрану, что не позволяет использовать ее для прижизненных измерений в реальном времени. Целью данной работы является разработка двулюциферазной системы, подходящей для использования в прижизненных экспериментах. В качестве люцифераз мы выбрали люциферазу P.plagiophthalamus, обладающую люминесценцией в зеленом диапазоне, и люциферазу L.curciata со пиком люминесценции в красной области. На основе данных репортеров мы разрабатываем генетические конструкции для изучения стрессового ответа клеток млекопитающих в реальном времени. Так, мы получили конструкцию, основанную на цитоплазматически сплайсируемой мРНК XBP1, являющейся сенсором стресса эндоплазматического ретикулума. Полученная конструкция реагирует на стресс, индуцированный туникамицином и тапсигаргином, увеличением продукции люциферазы. Кроме того, мы разрабатываем конструкцию, основанную на регуляторных участках гена ATF4, обеспечивающих увеличение его экспрессии в ответ на различные стрессы. Использование двух люцифераз с одним проникающим субстратом позволит одновременно отслеживать развитие стрессового ответа в клетке и его влияние на трансляцию репортерных мРНК с разными механизмами инициации трансляции, а также предсказывать реакцию клетки на экспрессию терапевтических мРНК, доставляемых составе липидных наночастиц.