ИСТИНА

Доклад в рамках практического семинара (мастер-класс), посвящённого исследованию ферментативной активности (ФА) почв и визуализации ее in situ в ненарушенных образцах (монолитах) с применением флюорогенномеченых субстратов. Целью проведения данного мастер-класса являлось знакомство исследователей-естествоиспытателей с зимографией – методом визуализации активности почвенных ферментов. Ферментативная активность почв, под которой понимают совокупность процессов, оказывающих каталитическое воздействие на превращения органических и минеральных соединений благодаря имеющимся в ней ферментам (Энциклопедический словарь терминов по кормопроизводству, 2013), может рассматриваться в качестве одного из показателей активности почвенной микробиоты. Как правило, активность ферментов определяют в почвенных суспензиях, фиксируя исчезновение специфичного субстрата или появление продуктов его распада. Полученные таким образом результаты характеризуют все типы ферментативной активности (внутриклеточная и внеклеточная), выделенные из взятого для анализа объема почвы. Существует метод, позволяющий визуализировать ФА и оценить ее пространственно в ненарушенных образцах (монолитах), – зимография. Данный метод не заменяет классический анализ ФА в почвенных суспензиях, так как отражает активность, связанную с поверхностью конкретного среза почвы (не с ее объемом!) и позволяет оценить активность только внеклеточных ферментов. Зимография основана на фиксации в ультрафиолетовом свете флуоресцентного соединения, которое высвобождается при реакции субстрата и фермента. Использование конкретного субстрата зависит от целей исследования – так, при оценке процессов, связанных с циклом углерода почв, часто анализируют активность β-глюкозидазы или целлобиогидралазы. Технически процесс состоит из нескольких этапов. Первым шагом мембранный фильтр, пропитанный точно известным количеством субстрата (который состоит из органической молекулы, связанной с флуоресцирующей меткой) размещают на ровный срез почвы. Далее необходимо обеспечить хороший контакт между поверхностью почвы и субстратом. В результате протекающей реакции флуоресцирующее соединение отщепляется от органической молекулы и начинает светиться в УФ-свете. Степень яркости соответствует его концентрации на мембране и фиксируется в УФ-свете. Получившаяся картина отражает пространственное распределение активных ферментов на поверхности почвы и называется зимограммой. Количественные данные получают путем пересчета с применением калибровочной кривой, построенной на основе растворов с известной концентрацией флуоресцирующего вещества. Для этого делают цифровой фотоснимок мембранных фильтров, пропитанных раствором точно известной концентрации, а затем его переводят в графическом редакторе в оттенки серого. Впервые для почв данный метод определения ферментативной активности с применением мембранных фильтров, предложен в лаборатории Университета Гёттингена в 2013 г. (Spohn, Kuzyakov, 2013), что стало прорывным этапом и поспособствовало расширению исследований активности микробиоты в ризосфере и влиянию структуры почв на активность микробиоты. Сегодня такой модификацией пользуются ученые в разных странах мира, т.к. очевидны достоинства метода – общедоступное оборудование и невысокая трудоемкость по сравнению с применением электрофорезных гелей, например. Мастер-класс проведен на базе лаборатории физики и гидрологии почв ФИЦ «Почвенный институт имени В.В. Докучаева». Зимографическая установка была собрана сотрудниками института и состоит из следующих основных частей (Тимофеева и др., 2022). Каркас рабочей области составляет лабораторная тяга (120 × 60 × 80 см), поверхности которой (столешница и стены) выкрашены черной обладающей способностью поглощать УФ-излучение краской. Жестко зафиксированная фотокамера, расположенная над центром рабочей области и отвечающая ряду требований, среди которых основными являются возможность удаленного управления и возможность сохранения данных в несжатый графический формат данных. А также УФ-светильники, расположенные таким образом, чтобы равномерно подсвечивать рабочую область. В рамках практического семинара участники смогли осмотреть конструкцию зимографической установки и ознакомиться с параметрами проведения анализа (параметры освещения, особенности фотоаппаратуры и режимов съемки, пробоподготовка образцов). Также были продемонстрированы зимограммы на примере реальных почв