ИСТИНА

Иммуномечение позволяет решить проблему идентификации белоксодержащих объектов, исследуемых с помощью просвечивающей электронной микроскопии. Суть метода заключается в выявлении специфичных антигенов на поверхности образца с помощью всего лишь двух основных реагентов: антител и используемых для проявления связывания конъюгатов на основе наночастиц золота. Однако, иммуномечение редко применяют на практике, так как оно представляет собой трудоёмкую процедуру, занимающую 3–5 часов. Методика иммуномечения включает блокировку поверхности альбумином для минимизации неспецифического связывания с последующим нанесением антител против целевого антигена и конъюгата. Каждый этап сопровождается отмывкой одномолярным фосфатно-солевым буфером. Завершающим этапом является окрашивание уранилацетатом для повышения контрастности образца. Результаты оценивают путём вычисления нормированной специфичности, которая отражает эффективность связывания конъюгатов с биообъектом с учётом доли его площади на снимке. Нам удалось адаптировать методику и сократить её длительность до ~2 часов за счёт уменьшения времени наиболее продолжительных шагов – инкубации, блокировки и отмывки. В качестве проявляющего агента использовали конъюгаты коллоидного золота с белком А. Наша методика была использована для исследования двух образцов – инактивированного вируса полиомиелита типа I штамма Sabin и внеклеточных везикул из среды культивирования клеток MCF7. Доля специфического связывания равна 93% для вирусов и 86% для везикул. Нормированная специфичность связывания конъюгатов с вирусными частицами и с везикулами составила 3,7 ± 0,5 и 14,8 ± 6,4 соответственно, что свидетельствует о высокой избирательности связывания, превышающей случайное распределение. Адаптированная методика демонстрирует высокую специфичность иммуномечения при значительном сокращении времени проведения анализа. Упрощённый протокол повышает практическую ценность методики, делая её удобной для применения в исследованиях широкого круга биологических объектов. Исследование выполнено в рамках государственного задания МГУ имени М.В. Ломоносова.