ИСТИНА

Цитоскелет эукариотической клетки состоит из микротрубочек, актиновых структур и промежуточных филаментов (ПФ), взаимосвязанных структурно и функционально. У млекопитающих только 2 изоформы из 6 (немышечные β- и γ-цитоплазматические актины (β-cytA и γ-cytA) присутствую во всех клетках организма, локализуясь в разных ее структурах, и различаются функционально. Чтобы понять, влияет ли состав актинового цитоскелета на формирование сети виментиновых ПФ, их распределение и связь с митохондриями; выяснить, есть ли функциональные различия между β- и γ-cytA в отношении защиты митохондрий при их повреждении, в настоящей работе, используя систему CRISPR Cas9, мы получили модельные клеточные линии фибробластов REF52, лишенные β-, либо γ-cytA. Чтобы получить REF52 (β-Act-/-) и REF52 (γ-Act-/-) с нокаутом генов β- и γ-cytA соответственно, были сконструированы плазмиды pSpCas9n(BB)-2A-puro-Act(1+2), кодирующие мутантную форму эндонуклеазы Cas9, способную делать одно-нитевые разрывы ДНК, ген устойчивости к пуромицину и две молекулы гидовых РНК, комплементарных к близко расположенным и разнонаправленным участкам в генах β- или γ-cytA. Трансфекция этими плазмидами и последующая селекция клеток при помощи пуромицина позволят выделить линии, экспрессирующие только одну из изоформ. Клоны проверяли на отсутствие β- либо γ-cytA, используя методы иммуноблоттинга и иммунофлуоресценции. Оказалось, что клетки, лишенные одной из изоформ, не теряют жизнеспособности и сохраняют фибробластоподобную форму. В клетках REF52(β-Act-/-) γ-cytA формирует характерную кортикальную сеть и актиновые стрессфибриллы, значительно менее выраженные, чем в клетках REF52 дикого типа. В клетках REF52 (γ-Act-/-) β-cytA формирует актиновые пучки, по количеству и толщине не отличающиеся от клеток REF52. Однако, in vitro физиологические характеристики клеток линий REF52 (β-Act-/-) и REF52 (γ-Act-/-) различаются: они по-разному распластываются на субстрате и в разное время переходят к движению; характер движения клеток, лишенных β- или γ-cytA, отличается как друг от друга, так и от клеток дикого типа. Кроме того, клетки, лишенные β-cytA, в два раза быстрее заполняют экспериментальную рану, а клетки, лишенные γ-cytA, заполняют экспериментальную рану медленнее, чем REF52. Поддержано грантом РНФ № 23-74-00036.