ИСТИНА

Репарация неканонических пар нуклеотидов или «мисматчей» (MMR) – процесс, в ходе которого исправляются ошибки, возникающие в ДНК при репликации в результате неточной работы ДНК-полимераз. MutS и MutL – ключевые белки MMR, ответственные за узнавание «мисматча» и инициацию гидролиза «дочерней» цепи ДНК. Интерпретация результатов, полученных при изучении начальных этапов MMR с участием этих белков, все еще противоречива. Исследования взаимодействия MutS и MutL друг с другом и с ДНК затруднены из-за динамического характера структуры этих белков, принимающих множество различных конформаций. Предложен метод ковалентной фиксации MutS и MutL из Е. сoli на ДНК, позволяющий проводить структурно-функциональные исследования системы MMR. Сконструированы ДНК, содержащие дисульфидную группировку (для «кросслинкинга» мутантных форм MutS или MutL с единственным остатком Cys в заданной позиции), и в ряде случаев флуорофоры (для проведения исследований методом FRET). Известно, что при образовании «окончательного» узнающего комплекса MutS с «мисматч»-содержащей ДНК происходит изменение структуры дуплекса, характеризующейся отсутствием изгиба двойной спирали. Нами показано, что скорость «выпрямления» ДНК возрастает с увеличением концентрации АТФ в реакционной смеси. Изучена кинетика образования комплекса флуоресцентно меченного белка MutL, находящегося в «открытой» или «закрытой» конформации, с различными конъюгатами MutS-ДНК. Установлено, что с наибольшей скоростью с конъюгатом MutS-ДНК взаимодействует «закрытая» форма MutL, формирующаяся при высоких концентрациях АТФ (1 мМ). В этом случае дуплекс зафиксирован в ДНК-связывающей области MutS. Впервые с высоким выходом получены ковалентно связанные комплексы MutL с ДНК. Показано, что аминокислотные остатки MutL в позициях 218 и 251 наиболее сближены с ДНК-лигандом. Присутствие белка MutS увеличивает выход и скорость образования конъюгатов мутантных форм MutL с модифицированной ДНК. Ковалентная фиксация MutS в области «мисматча» позволила установить, что перемещение комплекса MutS-MutL по ДНК не является обязательным условием для активации эндонуклеазы MutH, вносящей разрыв в ДНК.