ИСТИНА

В настоящей работе мы исследовали структурные свойства iRFP713, принадлежащего к семейству ближне-инфракрасных флуоресцентных белков (NIR FPs), применяемых в качестве проб для прижизненной визуализации процессов, происходящих в отдельных клетках и в целом организме с высоким разрешением в реальном масштабе времени. NIR FPs в качестве хромофора используют биливердин (BV), ковалентное присоединение которого влияет на стабильность и фолдинг белка. Ковалентное связывание BV оказывает с консервативным остатком цистеина в PAS домене белка или с введенным остатком цистеина в участке -SPXH- GAF домена оказывает существенное влияние на спектральные свойства NIR FPs. Наличие в структуре iRFP713 биливердина в качестве хромофора и необычного структурного элемента – узла, делает его интересным объектом для исследования процессов фолдинга. Было показано, что наличие узла в структуре iRFP713 не препятствует его эффективному рефолдингу. При исследовании процессов разворачивания – сворачивания iRFP713 под действием гуанидин гидрохлорида (GdnHCl) и гуанидин тиоцианата (GTC) был выявлен сдвиг величины середины денатурационного перехода белка, регистрируемый по параметрам триптофановой флуоресценции, в область больших концентраций денатуранта, по отношению к величине этого параметра, регистрируемого по флуоресценции хромофора или кругового дихроизма в дальней УФ-области. В присутствии GTC этот эффект был более выражен. Равновесные эксперименты по гель-фильтрации и кинетические спектроскопические измерения позволили нам выявить формирование двух промежуточных состояний в процессе разворачивания iRFP713. Показано, что iRFP713 накапливается в нативо-подобной мономерной форме, склонной к агрегации. Агрегация мономерной формы iRFP713, вероятно, вызвана нейтрализацией поверхностного заряда белка ионами GdnH+.