ИСТИНА

Одним из наиболее распространенных нейродегенеративных заболеваний является болезнь Паркинсона, развитие которой сопровождается образованием в мозге пациентов нерастворимых цитоплазматических агрегатов белков - телец Леви. Основным структурным компонентом телец Леви является нейрональный белок α-синуклеин (α-syn) в форме амилоидных фибрилл, которые представляют собой упорядоченные нерастворимые белковые агрегаты, богатые β-складчатой структурой. Для диагностики возникновения амилоидных фибрилл in vitro и in vivo широко используется специфический флуоресцентный зонд тиофлавин Т (ThT), интенсивность флуоресценции которого при встраивании в амилоидные фибриллы может возрастать на несколько порядков. Это делает ThT не только хорошим диагностическим агентом, но и инструментом для изучения процессов образования амилоидных фибрилл, а также их структуры. Проведение подобных исследований является актуальной задачей, поскольку неразрывно связано с поиском и разработкой потенциальных терапевтических агентов. Настоящая работа была направлена на изучение кинетики образования амилоидных фибрилл на основе α-syn с использованием электронной микроскопии (ЭМ), метода кругового дихроизма (КД), а также флуоресцентной и абсорбционной спектроскопии. Были зарегистрированы спектры поглощения, флуоресценции, возбуждения флуоресценции, а также кривые затухания флуоресценции ThT, что позволило оценить время жизни флуоресценции красителя, взаимодействующего с амилоидными фибриллами. Результаты, полученные с использованием различных подходов, свидетельствуют о том, что кинетика роста амилоидных фибрилл представляет собой сигмоидальную кривую. Фибриллогенез можно условно разделить на три этапа: фазу нуклеации (лаг-фазу), фазу роста фибрилл и фазу насыщения. В лаг-фазе, когда регистрируемые параметры остаются практически неизменны, происходит образование зародышей (ядер) амилоидных фибрилл; в следующей фазе начинается увеличение наблюдаемых характеристик, что свидетельствует о росте амилоидных фибрилл; далее происходит выход кривой на плато, что означает, что весь мономерный α-syn переходит в фибриллярную форму. Изменение спектров КД с постепенным увеличением содержания β-листов наблюдается только в фазе роста амилоидных фибрилл. При этом короткие амилоидные фибриллы, согласно данным ЭМ, образуются уже в конце лаг-фазы, а в фазе роста наблюдается их удлинение и кластеризация. Таким образом, в настоящей работе нами получены характеристики кинетики образования амилоидных фибрилл на основе α-syn без влияния каких-либо внешних факторов. Эти данные могут быть использованы при оценке влияния различных внешних факторов и потенциальных ингибиторов, таких как условия фибриллогенеза (pH, температура и др.), малые молекулы (SDS, ионы металлов и др.), шапероны, на процесс образования амилоидных фибрилл α-syn.