ИСТИНА

Флуоресцентный зонд тиофлавин Т (ThT) широко и эффективно используется для диагностики образования и исследования структуры амилоидных фибрилл, однако, представления о его фотофизических свойствах и модели его связывания с фибриллами до сих пор неоднозначны. Несмотря на то, что в литературе существуют убедительные доказательства мономерной модели связывания красителя с фибриллами, продолжают появляться работы, в которых исследователи пытаются найти доказательства того, что ThT встраивается в фибриллы в агрегированной форме. В частности, в одной из недавних работ с использованием квантово-химических расчетов была показана принципиальная возможность формирования эксимеров молекулами ThT и флуоресценция красителя, инкорпорированного в фибриллы, без каких-либо экспериментальных доказательств, была приписана эксимерной форме ThT. В связи с этим целью настоящей работы стало экспериментальное обоснование возможности (или невозможности) формирования эксимеров молекулами красителя в водном растворе и в связанном с амилоидными фибриллами состоянии. Были исследованы фотофизические характеристики красителя в водном растворе в широком диапазоне его концентраций: спектры поглощения, флуоресценции, возбуждения флуоресценции, а также времена жизни и анизотропия флуоресценции. Ключевым моментом при определении интенсивности флуоресценции ThT стало использование спектрофлуориметра Cary Eclipse, который, в отличие от большинства современных приборов, позволяет исследовать растворы в экстремально широком диапазоне их концентраций (0 - 3∙10-2 М) при одних и тех же условиях эксперимента. С использованием специально разработанного протокола была проведена коррекция зарегистрированных значений интенсивности флуоресценции ThT на первичный и вторичный эффекты внутреннего фильтра, что в настоящее время даже опытными исследователями либо не выполняется вообще, либо выполняется некорректно. Полученные результаты позволили впервые экспериментально показать, что ThT образует эксимеры при высокой концентрации в водных растворах. Показано, что спектр флуоресценции эксимеров ThT существенно сдвинут в длинноволновую область (λmax = 570 нм) по сравнению спектром флуоресценции мономерного красителя в водном растворе (λmax = 490 нм). Также показано, что спектр флуоресценции эксимеров ThT не имеет ничего общего со спектром флуоресценции красителя, встроенного в амилоидные фибриллы (λmax = 480-488 нм в зависимости от амилоидогенного белка), которые практически совпадают со спектром флуоресценции свободного красителя в водном растворе. Полученные результаты позволили получить экспериментальное подтверждение того факта, что ThT встраивается в амилоидные фибриллы в мономерной форме, а возрастание интенсивности его флуоресценции при этом обусловлено только молекулярно-роторной природой красителя, и, следовательно, нет оснований предполагать образование агрегатов молекулами красителя в связанном с фибриллами состоянии.