ИСТИНА

Дестабилаза-лизоцим – это полифункциональный фермент выделенный из секрета слюнных желез медицинской пиявки. Ранее в нашей лаборатории проведено клонирование кДНК гена, кодирующего этот фермент[1]. Получены данные о том, что экспрессия гена Ds2 в составе бакуловируса возможна в инфицированных клетках Spodoptera frugiperda, с выявлением в клеточном экстракте изопептидазной и лизоцимной активности[1,2]. Так же показано, что нативный очищенный фермент проявляет лизоцимную активность по отношению к клеточным стенкам Micrococcus lysodeikticus [3].Для проведения биологических и клинических испытаний рекомбинантного фермента дестабилазы-лизоцима необходимо получение значительного количества его в виде очищенного и рефолдированного препарата. В данной работе представлена модификация метода получения рекомбинантнантного фермента, разработанного ранее [4], путем оптимизации условий его получения и рефолдирования. Для экспрессии использовали штамм E. coli BL 21(DE3), в который с помощью электропорации вводили плазмиду несущую ген Ds2в составе вектора pQE30 . Индукцию проводили изопропил-β,D-тиогалактопиранозидом в конечной концентрации 0.1мМ.. Далее разрушали клетки лизирующим буфером, содержащем в состав которого входит 8М мочевину. Так как фермент обладает противомикробной активностью в отношении E. coli , в данной системе его можно получать только в составе телец включения. Нами показано, что 3х стадийное промывание телец включения физиологическим раствором обеспечивает более высокий уровень чистоты получаемого препарата. В состав конструкции, кодирующей ген Ds2 введен один 6 His участок, благодаря которому проводилась дальнейшая очистка целевого белка на колонке, содержащей иммобилизированные ионы Ni2+. Благодаря наличию аффинного домена, обладающего сродством к никелевому сорбенту на последнем этапе очистки использовали аффинную хроматографию, приводящую к получению конечного продукта очищенного более чем на 90%. Далее полученный фермент рефолдировали 20 кратным разведением буфером, содержащим окислительно-восстановительные реагенты (0,1М Трис-ацетат рН 8.1, 10мМ GSH, 1mM GSSG). Полученный препарат анализировали с помощью денатурирующего электрофореза в полиакриламидном геле и определяли его лизоцимную активность, используя клеточные стенки Micrococcus lysodeikticus. Таким образом, получен высокоочищенный рефолдированный рекомбинантный белок дестабилаза-лизоцим, который предполагается использовать в дальнейших биологических испытаниях. 1. Zavalova L., Lukyanov S.,Baskova I., Snezhkov E., Akopov S., Berezhnoy S., Bogdanova E., Barsova E., Sverdlov E.// Mol.Gen.Genet.1996.V.253.P.20-25. 2. Fradkov A., Berezhnoy S., Barsova E., Zavalova L., Lukyanov S., Baskova I., Sverdlov E.//FEBS Lett. 1996.V.390.P.145-148. 3. Zavalova L., Baskova I., Lukyanov A., Sass A., Snezhkov E., Akopov S., Artamonova I. et al.//Biochim. Biophys. Acta. 2000.V.1478. P.69-77. 4. Завалова Л.Л., Лзарев .Н., Левицкий С.А., Юдина Т.Г., Баскова И.П.// Биохимия. 2010. Т. 75, №9, (в печати).