ИСТИНА

Дестабилаза-лизоцим (Дест-Лиз) из секрета слюнных желез медицинской пиявки – полифункциональный фермент, обладающий эндо-ε-(γ-Glu)-Lys- изопептидазной, лизоцимной и неферментативной антимикробной функциями [1,2,3]. Действие фермента направлено на растворение стабилизированного фибрина и продукта его деградации- Д-димера в процессе тромболизиса, где реализуется изопептидазная функция Дест-Лиз [4]. Лизоцимная функция фермента выявляется по его способности разрушать клеточные стенки M.lysodeikticus и гидролизовать гексамер N-ацетил-глюкозамина. Дест-Лиз, лишенный обеих ферментативных функций, блокирует рост микроорганизмов, превышая при этом активность многих антибиотиков [5]. Фермент является одним из первых представителей малоизученной группы лизоцимов беспозвоночных, значительно отличающихся по первичной структуре от известных лизоцимов других групп [6], что определяет интерес к строению его каталитических центров. В настоящей работе с помощью сайт-специфического мутагенеза Дест-Лиз (116 аминокислотных остатков), выявлены аминокислоты (E14 и D26), входящие в каталитический лизоцимный центр фермента. Для этого нами были получены конструкции, кодирующие ген Дест-Лиз в составе плазмиды pQE30, несущие нуклеотидные замены Дест-Лиз E14A, Дест-Лиз D14A. Эти плазмиды были электропорированы в E. coli BL 21(DE3). Индукцию проводили изопропил-β,D-тиогалактопиранозидом конечной концентрации 0.1мМ. Далее разрушали клетки лизирующим буфером в состав которого входит 8М мочевина. Так как фермент обладает противомикробной активностью, в данной системе его можно получать только в составе телец включения. Нами показано, что 3х стадийное промывание телец включения физиологическим раствором обеспечивает более высокий уровень чистоты получаемого препарата. В состав конструкций, кодирующих мутантные гены, введен один 6 His участок, благодаря которому проводилась дальнейшая очистка целевых белков на колонке, содержащей иммобилизированные ионы Ni2+. Благодаря наличию аффинного домена, обладающего сродством к никелевому сорбенту возможно было использование на последнем этапе очистки аффинной хроматографии, приводящей к получению конечного продукта, очищенного более чем на 90%.Далее белки рефолдировали при 20-кратном разведении в буфере, содержащем окислительно-восстановительные реагенты (0,1М Трис-ацетат рН 8.1, 10мМ GSH, 1mM GSSG). Полученные препараты анализировали с помощью денатурирующего электрофореза в полиакриламидном геле. Исследование лизоцимной активности полученных рекомбинантных белков по отношению к клеточным стенкам M.lysodeikticus показало, что удельная активность немутированного рекомбинантного Дест-Лиз составила 400 eд.акт./мг относительно 41 000 eд.акт./мг для нативного фермента из медицинской пиявки и 50 000 eд.акт./мг для яичного лицоцима. Мутированные рекомбинантные формы Дест-Лиз лизоцимной активностью не обладали. Полученные результаты находятся в соответствии с данными исследования лизоцимного центра высокогомологичного Дест-Лиз лизоцима из двустворчатого моллюска Tapes japonica [7]. Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ (грант 09-04-12145-офи-м ) Литература: 1. Zavalova L.L., Baskova I.P., Lukyanov S.A., Sass A.V., Snezhkov E.V., Akopov S.A., Artamonova I.I., Archipova V.S., Nesmeyanov V.A., Kozlov D.G., Benevolensky S.V., Kiseleva V.I., Poverenny A.M., Sverdlov E.D. (2001)BBA, 1478, 69-77. 2. Nilsen I.W., Myrnes B. (2001)Gene, 269, 27-32. 3. Завалова Л.Л., Е.В.Кузина, Н.Б. Левина, И.П.Баскова.(1992)Биохимия, 57, 3, 468-472. 4.. Завалова Л.Л., В.Н.Лазарев, С.А.Левицкий, Т.Г.Юдина, И.П.Баскова.(2010)Биохимия, 75, 9, 1314-1324. 5. Zavalova L.L, Yudina T.G., Artamonova I.I., Baskova I.P.(2006) Chemotherapy, 52,158-160/ 6. Nilsen I.W., Overbo K., Sandsdalen E.,Sandaker E., Sletten K., Myrnes B. (1999). FEBS Letters, 464, 153-158. 7. И.П.Баскова, Л.Л. Завалова.(2008) Биоорганическая химия, 34, 3, 337-343.