ИСТИНА

Малые белки теплового шока (sHsp) широко распространены и выполняют функции, связанные с поддержанием белкового гомеостаза, регуляции процессов апоптоза, пролиферации, сворачивания белков и др. У человека обнаружено 10 представителей семейства малых белков теплового шока, многие из которых экспрессируются совместно. Формирование гетероолигомерных комплексов может существенно влиять на функции sHsp, поэтому изучение образования и свойств таких комплексов является важной задачей. В нашей работе мы исследовали химерные белки, состоящие из 4 повсеместно экспрессируемых малых белков теплового шока человека (HspB1, HspB5, HspB6, HspB8) и улучшенных цианового (eCFP) или желтого (eYFP) флуоресцентных белков. Размеры образующихся гетероолигомеров определяли методом гель-хроматографии. За процессом комплексообразования наблюдали по изменениям интенсивности и анизотропии флуоресценции флуоресцентных белков, входящих в состав химер. Методом гель-фильтрации установлено, что sHsp в составе химер, образуют комплексы с теми же партнерами, что и малые белки теплового шока дикого типа. HspB1 и HspB6 дикого типа образовывали два типа гетероолигомерных комплексов с молекулярными массами 100 и 300 кДа, а химеры этих белков образовывали только гетерокомплексы с молекулярной массой 270 кДа. Химеры, содержащие HspB5 и HspB6, также как и белки дикого типа образовывали только один тип гетероолигомеров. Используя метод флуоресцентной спектроскопии, мы смогли исследовать кинетику образования гетероолигомеров химерных белков в реальном времени, а также подтвердить данные, полученные при гель-фильтрации. Установлено, что скорость комплексообразования зависит от температуры и природы взаимодействующих белков. Используя метод анизотропии флуоресценции, мы подтвердили способность HspB1/HspB6, HspB5/HspB6 и HspB1/HspB5 образовывать гетероолигомерные комплексы. Однако ни при каких условиях мы не смогли обнаружить гетероолигомерные комплексы, сформированные при участии HspB8. Таким образом, установлено, что химеры с флуоресцентными белками могут быть использованы для исследования образования гетероолигомеров малых белков теплового шока, при этом избирательность взаимодействия не зависит от прикрепления флуоресцентных белков. В то же время размеры комплексов, образуемых белками дикого типа и их химерами, довольно сильно различаются. Это ставит под сомнение успешность использования флуоресцентных химер для локализации гетероолигомерных комплексов внутри клетки.