ИСТИНА

Фотоактивное соединение TUPS (1-тиоредопирен-3,6,8,-трисульфонат) использовали для ковалентной модификации определенных аминокислотных остатков цитохрома с из сердца лошади. TUPS присоединяли либо к нативным остаткам лизина, либо к введенным с помощью направленного мутагенеза в разные точки поверхности белка остаткам цистеина. В ответ на пульс УФ лазера, с помощью многоканальной спектроскопии, регистрировалась кинетика переноса электрона: а) от фотовозбужденного TUPS к окисленному гему и обратно; б) от восстановленного гема к TUPS и обратно. Показано таким образом, что TUPS подходит для инициации восстановительных и окислительных пульсов в редокс-белках. Сложную кинетику переноса электрона моделировали исходя из предположения о редокс-индуцированном изменении конформации в цитохроме с. Также, спектрофотометрически измерялся перенос электрона от меченого TUPS цитохрома с к бычьей цитохромоксидазе. Были исследованы несколько мутантных цитохромов с из сердца лошади, и один из них (A15C-TUPS) оказался наиболее удобен для индуцированного светом восстановления цитохромоксидазы. Быстрое фотоиндуцированное восстановление цитохрома с сопровождалось эффективным восстановлением гема а цитохромоксидазы. Кинетика переноса электрона между TUPS и гемом с зависила от присутствия цитохромоксидазы, что объясняется стабилизацией восстановленной формы гема с, вызванной связыванием цитохрома с с оксидазой. Дрожжевой изо-1 цитохром с, несущий коваленто пришитый к остатку C102 TUPS, также был использован для переноса электрона в окисленную бычью цитохромоксидазу. К моменту установления равновесия между гемом с и гемом а (примерно 400 мкс после начала реакции) гем а оказывался заметно менее восстановлен при щелочных значениях pH, чем при нейтральных. Это наблюдение находится в соответствии с зависимостью от pH среднеточечного потенциала гема а, измеренного ранее в статических условиях. Em/pH зависимость гема а проявляется и во временной шкале оборота фермента, а следовательно, имеет значение для катализа.