Аннотация:Регуляторный потенциал коротких открытых рамок считывания (кОРС), расположенных выше стартового кодона основной кодирующей последовательности, впервые был описан в 80-х годах прошлого века. Однако только сейчас становится все более очевидной биологическая значимость кОРС-опосредованного контроля трансляции мРНК. Тем не менее, уровень наших знаний в этой области можно назвать неудовлетворительным, поскольку на данный момент существует лишь ограниченное число хорошо изученных примеров, а целостная картина отсутствует. Многие случаи имеют важное физиологическое значение и нуждаются в детальном исследовании.
Регуляция трансляции посредством кОРС привлекла наше особое внимание в ходе изучения фактора инициации трансляции eIF2D, открытого и охарактеризованного в нашей лаборатории. На сегодняшний день исследование функции этого белка в живой клетке является одним из наших приоритетных направлений. Однако ряд структурных особенностей мРНК eIF2D, которые непосредственно влияют на трансляцию этой матрицы, склонили нас к ее более детальному изучению. мРНК человеческого eIF2D имеет необычную организацию 5`-нетранслируемой области (5`-НТО): нуклеотидная последовательность характеризуется повышенной консервативностью среди млекопитающих; высоким процентом GC-нуклеотидов (~70%), что предполагает сложную вторичную структуру; наличием кОРС и другими особенностями. В литературе описаны случаи мРНК со сложно устроенными 5’ НТО, трансляция которых специфически регулируется в условиях различных клеточных стрессов.
Ранее в нашей лаборатории был проведен скрининг веществ, вызывающих клеточные стрессы различного типа, на предмет их избирательного воздействия на эффективность трансляции мРНК, содержащей 5’ НТО eIF2D. Он показал, что трансляция такой матрицы имеет повышенную чувствительность к условиям гиперосмотического стресса в клетках HEK293T в сравнении с контрольной мРНК, содержащей простой недлинный лидер.
Полученные результаты подтолкнули нас к вопросу о том, какие именно свойства 5’ НТО мРНК eIF2D отвечают за специфический эффект подавления ее трансляции в условиях гиперосмотического стресса – в частности, к вопросу о роли кОРС. Таким образом, на основе уже полученных данных мы обозначили цель дальнейшей работы – определить молекулярные механизмы, лежащие в основе повышенной чувствительности трансляции мРНК, содержащей 5’ НТО гена eIF2D человека, к гиперосмотическому стрессу.
Мы поставили перед собой следующие экспериментальные задачи:
- получить молекулярно-генетические конструкции – репортерные мРНК с различными вариантами 5’ НТО eIF2D, кодирующие люциферазу светлячка;
- сравнить эффективность трансляции полученных мРНК в клетках млекопитающих методом кратковременной РНК-трансфекции (в норме и при гиперосмотическом стрессе) и в бесклеточной системе трансляции (при увеличивающихся концентрациях NaCl);
- выявить детерминанты в 5’ НТО мРНК eIF2D, определяющие повышенную чувствительность трансляции этой мРНК к гиперосмотическому стрессу.
В результате работы были сделаны следующие выводы:
1. Трансляция репортерной мРНК с 5’ НТО гена eIF2D человека специфически подавляется в культивируемых клетках млекопитающих в условиях умеренного гиперосмотического стресса, вызванного повышением концентрации NaCl в среде;
2. Наличие кОРС в репортерной мРНК с 5’ НТО гена eIF2D имеет принципиальное значение для феномена гиперчувствительности трансляции этой мРНК к данному виду стресса;
3. Такие параметры кОРС как длина, аминокислотная последовательность, расстояние до основной рамки, тип стоп-кодона по отдельности не оказывают принципиального влияния на феномен гиперчувствительности;
4. Наличие кОРС в лидерной последовательности не является параметром, достаточным для проявления свойства гиперчувствительности трансляции мРНК с 5’ НТО гена eIF2D к данному виду стресса;
5. Трансляция репортерной мРНК с кОРС-содержащей 5’ НТО гена MDM2 человека проявляет аналогичную гиперчувствительность к повышенной концентрации NaCl в среде;
6. Падение уровня трансляции изучаемых в работе мРНК не связано с их избирательной деградацией в клетках, подвергнутых стрессовому воздействию;
7. Оптимум трансляции мРНК с 5’ НТО гена eIF2D человека по отношению к концентрации NaCl в цитоплазматическом экстракте не зависит от присутствия в ней кОРС – следовательно, описанный нами феномен гиперчувствительности её трансляции в живых клетках, скорее всего, связан с активацией в них антистрессового ответа.