|
ИСТИНА |
Войти в систему Регистрация |
ИСТИНА ИНХС РАН |
||
Изучение трансляционных событий на стоп-кодонах репортёрных мРНК в бесклеточной системедипломная работа (Бакалавр)
- Научные руководители: Гладышев В.Н., Дмитриев С.Е.
- Автор: Шлык Валерия Ивановна
- Тип: Бакалавр
- Организация, в которой проходила защита: МГУ имени М.В. Ломоносова
- Год защиты: 2018
- Аннотация: Биосинтез белка является одним из основополагающих процессов, присущим всем живым клеткам. В его основе лежат сложнейшие механизмы, которые до сих пор еще не до конца изучены. Данный процесс можно разделить на четыре основные стадии: инициацию, элонгацию и терминацию трансляции, а также рибосомный рециклинг. При этом две последние стадии изучены наиболее слабо, хотя известно множество тяжелых генетических заболеваний, которые вызваны нарушениями именно терминации трансляции или рециклинга [Agrelo et al, 2015; Brendel et al, 2011]. Часто встречающейся причиной генетических заболеваний являются нонсенс-мутации, приводящие к появлению преждевременных стоп-кодонов и, как следствие, усеченных белков. Возможные методы лечения могут быть связаны со стимуляцией сквозного прочтения преждевременных стоп-кодонов (англ. «readthrough»), что приведет к образованию некоторого количества полноразмерного белка. Хотя такой белок, скорее всего, будет содержать аминокислотную замену по сравнению с вариантом, закодированным в немутантной версии гена, его функциональность с высокой вероятностью останется ненарушенной. Для осуществления процесса сквозного прочтения уже сегодня тестируется несколько антибиотиков, способных подавлять терминацию на преждевременных стоп-кодонах. Сложности в изучении стадии терминации на сегодняшний день связаны в основном с трудоёмкостью существующих методов анализа этого процесса, поэтому актуальной задачей является создание простой масштабируемой системы, с помощью которой можно было бы изучать данные процессы и тестировать различные лекарственные препараты. Такую систему можно было бы создать, например, на основе бесклеточной трансляционной системы и репортерных мРНК-конструкций, позволяющей проводить быстрый и эффективный анализ продукта трансляции, выход которого каким-либо особым образом зависел бы именно от стадии терминации. Таким образом, была определена цель дальнейшей работы: разработать систему на основе оригинального набора репортёрных мРНК, которая позволит оценить эффективность и скорость терминации трансляции в эукариотической бесклеточной системе. У нас родилась идея использовать для достижения этой цели феномен, открытый ранее В.Колбом, Е.Макеевым и А.Спириным (Институт белка РАН) [Kolb et al, 1994], который заключается в том, что при синтезе белка люциферазы светлячка растущая полипептидная цепь может приобретать правильно свернутую конформацию прямо во время трансляции. При этом люцифераза не может сформировать полностью активную молекулу, пока ее С-концевой фрагмент находится в рибосомном пептидном тоннеле, поскольку этот фрагмент абсолютно критичен для окончательного формирования активного центра. Однако сразу после терминации, приводящей к высвобождению полного белка и выходу С-концевого фрагмента белка из тоннеля, люцифераза приобретает свою активность практически мгновенно. Если же снабдить кодирующую часть люциферазы небольшим С-концевым «довеском» такой длины, чтобы закодированный в нем продукт заполнял тоннель и позволял цепи люциферазы полностью появиться из него, то фермент будет приобретать активность еще до отделения от рибосомы – т.е. до терминации. Таким образом, сравнение результата трансляции двух мРНК, кодирующих люциферазу с С-концевым «довеском» и без него, должно позволить специфически оценить вклад именно стадии терминации. Подробнее эта идея описана ниже. Для достижения поставленной нами цели были сформулированы следующие экспериментальные задачи: • Создать молекулярно-генетические конструкции, кодирующие два варианта люциферазы: с С-концевым «довеском» и без него; • Получить на основе этих конструкций набор репортерных мРНК, отличающихся определенными параметрами (длиной 3’-нетранслируемой области, нуклеотидным контекстом стоп-кодона) и сравнить количество и время появления продуктов их трансляции в бесклеточной системе, оценив таким образом разницу в эффективности и скорости терминации трансляции для этих случаев; • Проверить специфичность ряда потенциальных ингибиторов трансляции (низкомолекулярных и белковых), сравнив количество и время появления продуктов с С-концевым «довеском» и без него в присутствии и в отсутствие этих ингибиторов.
- Добавил в систему: Дмитриев Сергей Евгеньевич