Аннотация:В 1964 году был найден первый денсовирус – денсовирус бабочки Gallería
mellonella. С этого момента прошло достаточное количество времени, однако до сих пор
денсовирусы насекомых являются одной из самых мало изученных групп парвовирусов.
Ученые только начинают раскрывать особенности биологии и патологии этой группы
вирусов, что делает денсовирусы очень интересной и перспективной областью для
исследования.
Изучение денсовирусов может помочь в понимании взаимодействия вируса и
его хозяина. С помощью исследования механизмов экспрессии денсовирусных генов и
сплайсинга транскриптов этих генов в инфицированном организме можно понять, каким
образом осуществляется эффективный синтез дочерних вирусных частиц и как клетки
насекомого пытаются предотвратить этот процесс. Эти знания могут помочь в борьбе с
вредоносными насекомыми путем использования денсовирусов в качестве
биологического средства для борьбы с сельскохозяйственными вредителями.
Денсовирус рыжего таракана, открытый в 2000 году, представляет большой
интерес не только в научном, но и в практическом плане. Так, изучение формирования
вирусоподобных частиц из капсидных белков VP3 денсовируса рыжего таракана в
дальнейшем может позволить создавать вакцины на основе этих вирусоподобных частиц.
Цель работы:
Изучить экспрессию генов капсидных белков денсовируса рыжего таракана и
сплайсинг транскриптов этих генов в трансгенных линиях D. melanogaster, исследовать
самосборку вирусоподобных частиц в трансгенных линиях дрозофил.
Задачи исследования:
1. Исследовать сплайсинг транскриптов генов капсидных белков VP1, VP2, VP3
денсовируса рыжего таракана в трансгенных линиях D. melanogaster.
2. Изучить характер сплайсинга транскрипта гена капсидного белка VP2, в котором
искусственно нарушена рамка считывания капсидного белка.
3. Исследовать экспрессию капсидных белков VP1, VP2 и VP3 денсовируса рыжего
таракана в трансгенных линиях D. melanogaster.
4. Методом трансмиссионной электронной микроскопии выявить вирусоподобные
частицы в линиях D. melanogaster, содержащих клонированную
последовательность капсидного белка VP3 денсовируса рыжего таракана.
ВЫВОДЫ
1) Охарактеризован паттерн сплайс-вариантов транскриптов генов капсидных
белков (VP1, VP2, VP3) денсовируса рыжего таракана в трансгенных линиях Drosophila
melanogaster, активируемых транскрипционным фактором GAL4 под контролем
промотора гена alphaTub84B. Показано, что в отличие от ранее описанных сплайсвариантов РНК гена VP2 (при активации экспрессии под контролем промотора гена
Act5C) в проведенных нами экспериментах не наблюдалось амплифицированных
фрагментов, соответствующих несплайсированному транскрипту.
2) Показано, что при активации экспрессии гена VP3 транскрипционным фактором
GAL4 под контролем промотора гена alphaTub84B, также как и при активации под
контролем промотора гена Act5C, в трансгенной линии D. melanogaster не происходит
сплайсинга исследуемого транскрипта. Методом Вестерн-блоттинга показан синтез
белкового продукта, соответствующего нативной форме белка VP3.
3) Впервые показано, что при экспрессии в трансгенных линиях D. melanogaster
гена VP2, содержащего мутацию, приводящую к сдвигу рамки считывания и,
соответственно, блокирующую трансляцию РНК, происходит формирование сплайсвариантов, не отличимых по размеру от сплайс-вариантов нативного гена.
4) Методом трансмиссионной электронной микроскопии в имагинальных дисках,
головном ганглии и слюнных железах личинок трансгенных дрозофил проведено
исследование вирусоподобных частиц (ВПЧ), формируемых за счет самосборки
капсидного белка VP3. В слюнных железах выявлены структуры, предположительно
соответствующие по размеру искомым ВПЧ.