Изучение механизмов биосинтеза белка в культивируемых клетках мыши с использованием технологии CRISPR/Cas-опосредованного геномного скринингадипломная работа (Магистр)
Аннотация:Жизнь характеризуется многообразием катализируемых химических реакций, большинство из которых осуществляется белками. Белки в клетке синтезируются рибосомой с использованием матрицы мРНК. В процессе биосинтеза белка рибосома пользуется молекулами-посредниками, тРНК, которые предоставляют интерфейс соответствия между последовательностью нуклеотидов мРНК и аминокислотами синтезируемого белка. Рибосома декодирует записанную в мРНК информацию порциями по три нуклеотида (триплетами) за раз, именно такую длину имеет участок комплементарного спаривания между мРНК и тРНК. Подобная система записи генетической информации получила название генетического кода, всего возможно 64 триплета, использующих 4 буквы генетического алфавита. 61 из 64 кодонов используется клеткой для кодирования аминокислот, каждому из этих кодонов соответствует одна аминокислота, что позволяет однозначно переводить информацию из последовательности нуклеотидов в последовательность аминокислот.
Однако три кодона выполняют особую роль, с ними не взаимодействует ни одна тРНК клетки, а служат они сигналом остановки синтеза белка. Эти кодоны имеют последовательность UAG, UGA, UAA и имеют собственные названия: соответственно, Янтарь, Опал и Охра. В эукариотических клетках эти кодоны распознает фактор терминации трансляции eRF1, который в комплексе с фактором eRF3 обеспечивает высвобождение белковой цепи. Окончание синтеза неразрывно связано с процессом разборки рибосом на субъедницы, рециклингом, для дальнейшего их вовлечения в новые раунды синтеза.
Классические работы описывают терминацию трансляции как процесс, обеспечиваемый всего двумя терминационными факторами, eRF1 и eRF3. В настоящее время появляется все больше свидетельств участия и других белков в терминации трансляции и последующей разборке рибосом. Так, например, последние работы показывают вовлеченность белков ABCE1, PABP, eIF3, PAIP1, PAIP2, Gle1, Upf1, Dbp5 в терминационные события у разных модельных организмов. Также обнаружено множество случаев регуляции терминации цис-действующими последовательностями мРНК. Исследование этих механизмов открывает путь к лечению многих наследственных заболеваний, вызванных появлением в генах преждевременных стоп-кодонов.
Растущее количество данных свидетельствует о нашем неполном понимании событий, происходящих во время терминации трансляции и после неё. Несмотря на фундаментальную значимость существующих работ, слабой их стороной является преимущественное использование реконструированных in vitro систем. Это потенциально может привести к открытию артефактных явлений и не позволяет системно проверять белки на их причастность к событиям терминации. Это побудило нас разработать модель, позволяющую оценить эффективность терминации трансляции в живой клетке, и провести полногеномный скрининг с использованием этой системы и технологии CRISPR/Cas9.